微量全转录组测序（Smart-seq2）样本送样指南
1.细胞样品
适宜细胞类型：适用于哺乳动物细胞以及其它无细胞壁的真核细胞。
不适宜样本类型：植物，真菌，细菌等有细胞壁结构以及经过任何形式固定的细胞，均不适用。
细胞数量要求：以1-1000个细胞为宜（最适细胞数为50-400个），过多的细胞会对反应有一定的抑制作用（注：如果取1个建议加入三倍体积以上的TRIzol裂解液，不到500 μL直接加入500 μL TRIzol裂解液，我们会先提取RNA根据RNA完整性再决定是否进行预扩增。细胞样本与裂解液混合后必须在7天内开展预扩增!!!（需要考虑送样当天和快递途中的时间），保存时间过长裂解液成分容易失效。
2.RNA 样品
RNA 样品需要量：纯化后的10 pg-10 ng 总RNA。
RNA样本质量要求：理论上真核生物总RNA均可适用，对于已经纯化的RNA样品，进行实验操作前，在样品量足够的情况下我们推荐使用Agilent RNA 6000 Pico Kit评价RNA完整性。建议使用完整性高的样品进行实验，以完整性差的RNA作为预扩增起始模板会影响cDNA 的产出和完整度，导致反应失败。
3. 样品前处理
样品准备步骤
1）实验开始前准备好干冰；
2）细胞样品必须尽可能去除培养基、酶等可能存在的杂质。对于400个以内的细胞样本，将细胞重悬于装有8μL PBS的PCR管（200μL，RNase Free）中，再按照细胞样品体积:裂解液体积=4:1的比例加入2μL Smart裂解液（公司提供），针对易受损细胞类型，比如免疫细胞、小胶质细胞等，可额外再加2μL巯基乙醇；400-1000个细胞，各试剂体积需要依次增加，详见下表。添加完裂解液（以及巯基乙醇）后迅速混匀，迅速冻存于-80℃，干冰运输。
*选做：针对易受损细胞类型，比如免疫细胞、小胶质细胞等，取样/实验异常，可以尝试。
3）细胞数在1000-5000个范围内的样本，建议取用1000个细胞进行预扩增；5000个以上细胞样本，建议1×PBS（RNase Free）清洗 2 次后重悬，建议加入三倍体积以上的TRIzol裂解液，不到500 μL直接加入500 μL TRIzol裂解液，我们会先提取RNA根据RNA完整性再决定是否进行预扩增。
4）转移样品至200μL离心管（RNase Free）中，当样本总体积≥20μL时，建议采用螺口冻存管；
5）对于RNA样本，将RNA溶于TE溶液（RNase Free）或Nuclease-free H2O中，混匀，迅速冻存于-80℃，干冰运输（切勿在RNA样品中加入我司提供的裂解液）。
6）包装样品，干冰寄送。
前处理注意事项
1）推荐每个样本采集三个以上的重复，避免后期重复采样。建议使大口径枪头重悬细胞，以减少对细胞的损伤，每次移液前先混匀细胞悬液，然后从样品管中部吸取，弃上清时注意不要破坏细胞沉淀。前处理得到的细胞样品，均建议直接存放在200μLPCR管中，以避免后续实验中因为转管操作，造成样品细胞因挂壁丢失损耗。
2）在细胞量足够的前提下，每个样本，尤其是通过磁珠分选或流式分选等方法得到的细胞， 请务必测定细胞活性，并在样本提交单上写明细胞活率、细胞浓度和细胞总量（测定方法详见3.4），细胞活率要求>90%（比较难处理的样本需要>80%），细胞活率过低会严重影响预扩增效率。
3）细胞培养基中的成分可能会抑制cDNA的合成，所以应尽可能去除培养基后以PBS重悬细胞后，再加入裂解液。细胞样本与裂解液混合后必须在7天内开展预扩增!!!（需要考虑送样当天和快递途中的时间），保存时间过长裂解液成分容易失效。裂解液中含有RNA酶抑制剂，需要储存于-20℃，使用前冰上融化。裂解液在4℃环境中有效期一般为一周，避免反复冻融。
4）每一个样品加入裂解液后，立即置于干冰上，再操作下一个样品，该步骤完成后直至样品进行预扩增实验前，样品必须始终处于冷冻状态。取样完成后再根据实际情况进行-80℃储存或者干冰运输寄送。
5）胰脏、肾脏、血液等富含内源性RNA酶的组织在分离到细胞样本后，务必按照PBS:裂解液=4:1 加入我司提供的裂解液，再加入终浓度1%的β-巯基乙醇进行保存及运输，以便提高该类样本预扩增成功率。
6）取样完成之后，第一时间处理好样本并寄送至联川实验室，请务必在样本提交单上写明样本的具体来源（组织部位），同时联系销售发送样本提交单与快递单号给项目管理，我们会及时追踪样本情况，并在收到样本核对无误后第一时间进行下游实验。
样本获取方式
悬浮细胞：悬浮细胞一般推荐采用低速离心收集（800-1000g，5min），得到的细胞沉淀以PBS（RNase Free）清洗2次后重悬。根据实验需要取适量样品，迅速转移至200μL洁净的PCR（RNase Free）管中，立刻进行实验或者按照PBS:裂解液=4:1加入我司提供的裂解液保存或者运输。原代细胞或培养的传代细胞可能存在微生物/支原体污染，原则上建议客户自行确认。
贴壁细胞：去除培养基后以PBS（RNase Free）清洗2次，胰蛋白酶消化解离为悬浮细胞， 低速离心收集细胞（800-1000g，5min），得到的细胞沉淀以PBS（RNase Free）清洗2 次后重悬。根据实验需要取适量样品，迅速转移至200μL洁净的PCR（RNase Free）管中，立刻进行实验或者按照PBS:裂解液=4:1加入我司提供的裂解液保存或者运输。
流式细胞仪分离细胞：流式细胞仪分离的细胞，如为单个细胞则需重悬于5μL的PBS（RNase Free）溶液中，如细胞量比较大，则PBS体积可根据实验需要酌情适量增加（PBS体积应介于1细胞/μL~200细胞/μL之间）。迅速转移至200μL洁净的PCR（RNase Free）管中，立刻进行实验或者按照PBS:裂解液=5:1加入我司提供的裂解液保存。
组织：组织经酶（胰蛋白酶、胶原酶）消化，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，低速离心收集细胞（800-1000g，5min），得到的细胞沉淀以PBS（RNase Free）清洗2次后重悬。根据实验需要取适量样品，迅速转移至200μL洁净的PCR（RNase Free） 管中，立刻进行实验或者按照PBS:裂解液=4:1（单管总体积10μL）加入我司提供的裂解液保存或者运输。
细胞活性测定方法
由于细胞的基因表达是瞬时变化的，细胞类型、细胞活性及细胞所处周期的不同都会显著影响最终的cDNA产出。细胞的获取方式对细胞活性存在不同程度的影响，我们建议在每次收集完细胞样品后对细胞活性进行鉴定，死亡的细胞会发生明显的RNA降解并导致反应失败。鉴定合格后建议尽快寄到我司进行下游实验，不合适的保存条件会导致细胞中的RNA降解。可以提前利用Countstar或者Countess类细胞计数仪进行细胞活性检测；也可以提前利用血球计数板法进行细胞活性检测，具体方法如下：
1）轻缓吹匀细胞悬液后，吸取3μL细胞悬液加入到3μL台盼蓝染液（0.4%），吹打混匀后取6μL至血球计数板，用倒置显微镜观察细胞计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。（细胞量不足时，可将细胞悬液稀释，例如取1μL细胞悬液+2μLPBS稀释，再加入3μL台盼蓝）。
2）细胞计数：如图1所示，分别记录计数血球计数板上4个角落大格（白色部分共64小格） 的活/死细胞数至少两次，当两次数值误差大于20%时，需要计数第三次，最后取最相近两
次计数的平均值。
3）计算细胞浓度：细胞浓度≈（4个角落大格的活细胞总数+死细胞数）*5（cells/μL）。
4）细胞活率=活细胞总数÷细胞总数。
5）细胞总量=细胞浓度*稀释倍数*细胞悬液体积（μL）。
图1 血球计数板