转录调控组学

外泌体miRNA测序样本送样指南

1.RNA测序组织保护液使用指南

RNA测序组织保护液可以使样品收集简便化，单一试剂即能立即使RNA酶失活，从而稳定组织或细胞内的RNA。这边联川生物强烈推荐客户优先使用RNA组织保护液，既能保证组织RNA稳定性，提取RNA后拥有良好的质检结果。后期转录组等测序结果的PCA聚类结果表明，RNA测序组织保护液处理组的样本一致性先显著优于液氮速冻处理的样本！

请注意，RNA组织保护液不能全部装满冻存管或离心管，防止热胀冷缩液体外渗，盖子有条件强烈建议加上封口膜。如果客户自行购买，这边RNA组织保护液推荐品牌为Ambion的RNAlater (货号AM7021) 和Qiagen (货号76104) 。

前期可以向公司免费申请若干RNA组织保护液给客户使用。具体可以咨询销售助理及大区经理获取RNA组织保护液免费申请事宜，一次性建议申请多管，大客户可存放15mL以上的RNA组织保护液直接存放在客户实验室。

 

RNA测序组织保存液包含以下这些优点：

① 能在任何时间、任何地点收集组织样品，并且在需要时可延后处理；

② 灵活性更强，不需要在液氮中冷冻样品或者立即将样品送回实验室冰箱，消除了冷冻和/或碾磨的需求；

③ RNA能够在37℃稳定存放1天，25℃稳定存放一周，4℃保存1个月或在-20℃和-80℃中长期存放；

④ 后期转录组测序或表达谱芯片聚类结果更好，远优于液氮速冻处理的样本；

⑤  当快递和物流不稳定时，RNA组织保护液可以有效保护样本在提取后RNA质量仍然很完整。

 

RNA组织保护液适用组织（仅推荐）

 

RNA组织保护液/RNA测序组织保存液的使用：

①组织样本一般控制在黄豆大小（0.5cm³，20-50mg，若取样量过大需要切成多份黄豆大小的组织），保存液体积一般为组织体积的5-10倍，保证组织完全浸没于保存液中。（例如：0.5g的样品加入2.0-5.0mL的RNA组织保护液即可）；

②将组织样本放入RNA组织保护液后，不要立即冷冻，需4℃保存过夜后，再转到-20℃或-80℃（梯度降温），使得RNA组织保护液充分浸润样本；

③组织样本放在RNA组织保护液中，可在室温（25℃）下保存1周，在4℃下保存1个月或在-20℃和-80℃下长期存放。

注意事项：

a.未使用/未开封的RNA组织保护液在室温保存下，有效期一般为9-12个月。RNA组织保护液开封后请立即使用。

b.骨组织同样可以使用保存液保存，需要注意控制组织大小（不大于黄豆大小）。

c.细胞样品、植物样品不建议使用RNA组织保护液保存。

d.若-80℃或液氮保存的组织块的长宽高＜0.5cm，取出后可直接放入RNA组织保护液中进行干冰寄送。

e.经过RNA组织保护液处理并且冰冻的样品能用研钵和研杵碾磨，或者使其解冻后像处理新鲜组织一样操作，而不影响RNA的质量。

 

避免使用TriZol类裂解液保存组织（提取成功率极低），除以下情况外：

① 微量样本，肉眼几乎无法看到（如发育期的胚胎，角膜等）；

② 样本状态介于细胞与组织之间（如类器官，3D细胞培养物等）。

 

2.动物组织/临床组织采集

① 取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm，考虑到可操作性，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小；

② 去除非研究的组织类型（如结缔组织，脂肪组织等），如果是临床病变组织的取材要正确判断病变以及正常组织，应将病变组织周围的正常组织去掉，反之亦然；

③ 迅速用2-6℃预冷RNase-Free水配制的1×PBS或生理盐水清洗组织表面的血迹和污渍，使用无尘纸巾吸干表面的液体；

④ Plan A：处理好的组织迅速放入预冷的已写好编号的RNase-Free的带螺纹口的耐-192℃超低温冻存管中，迅速置于液氮速冻1小时后转存于-80℃长期保存，在RNA提取前避免反复冻融。

Plan B：先在冻存管中放入0.5-1.5mL左右的RNA组织保护液，然后将处理好的组织放入冻存管中，保证组织被充分没入。在4℃下保存过夜后，在-20℃或-80℃长期保存。

注意事项：

a.联川生物强烈推荐使用RNA组织保护液或类似组织保存液保存样本！请严格按照操作说明进行，迅速将样本分割成长宽高≤0.5cm，约豌豆大小的小块（一般重约100mg，不过无需精准测量，一般需要切成10个小块左右）。因为组织块过大会影响RNA组织保护液渗透入组织内部的效率，也会造成RNA组织保护液无法完全覆盖组织，未被RNAlater覆盖的组织部位极易被核酸酶降解。然后投入提前准备好的装满RNAlater的1.5mL的EP管中，使样本完全浸没在液体中，在4℃下保存过夜后，在-20℃或-80℃长期保存。若要运输，只需3-4个冰袋即可。

b.不允许寄送用裂解液保存的组织样本，因为实验中发现用TriZol保存的组织样本，无论是研磨好的粉末还是切割好的组织块，所抽提的RNA质量普遍很差。

c.动物及临床组织不要使用锡箔纸包裹，锡箔纸容易与动物及临床组织粘一起，RNA抽提的过程锡箔纸容易带入，引起污染。

 

3.细胞样品的采集

 

 

贴壁细胞的处理：

① 一次RNA提取反应所需细胞数≥1×10⁶个，以3×10⁶-1×10⁷个为宜。从培养箱取出贴壁生长细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好后弃培养基；

② 小心加入与培养基等体积的无酶水配制的1×PBS（室温）后，平放1min洗涤细胞，然后弃尽PBS，重复一次；

③ 加入适量细胞裂解液反复吹打至充分裂解（以TriZol为例，10-15cm的大皿或者1×10⁷个细胞左右，每次先添加1mL TriZol裂解液，吹打混匀，裂解充分标准为吹打后液体不粘稠，无成团细胞块，流动性好。如果液体过于粘稠说明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100μL左右，持续添加直到液体不粘稠，呈透亮状态为止）；

④ 将裂解好的细胞转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃冰箱长期保存，干冰运输。

 

悬浮细胞的处理：

① 一次RNA提取反应所需细胞数≥1×10⁶个，以3×10⁶-1×10⁷个为宜。选取生长状态良好的细胞悬液；

② 200-1000g，4℃下离心5-10min，得到细胞沉淀弃培养基；

③ 加入适量 RNase-Free水配制的1×PBS后，宽口枪头轻柔吹打重悬细胞沉淀，然后用200g离心5min，弃PBS，重复一次；

④ 加入适量TriZol裂解液反复吹打至充分裂解（裂解标准同上面的贴壁细胞处理方式类似）；

⑤   转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃长期保存，干冰运输。

 

显微切割细胞的处理：

一次RNA提取反应所需细胞数≥1×10⁶个，以3×10⁶-1×10⁷个为宜。激光显微切割获得的样品收集在专用收集管中，加入20-50μL裂解液（Invitrogen 12204），42℃水浴30min，-80℃保存，干冰寄送。

 

注意事项：

a.勿将干冻的细胞直接寄送，因为细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会释放核酸酶造成RNA降解；

b.细胞样品勿用胰酶消化，胰酶会消化细胞膜上的膜蛋白，操作不当会导致细胞破裂，破裂的细胞会释放核酸酶。

 

4. 类器官样品采集

样本解离方法：

① 去除培养板的孔中的培养基，加入1ml预冷的含0.1%BSA 的PBS，轻柔吹打3-5次，将 Matrigel从板底吹起并打碎，将悬液移入15ml离心管中；

②   将类器官在4℃，300-500xg离心5分钟，去除上清，加预冷的PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；

③   加入适量裂解液反复吹打至充分裂解（以TriZol为例，10-15cm的大皿，每次先添加1-2mL，吹打混匀，裂解充分的标准为吹打时液体不粘稠，流动性好。如果液体过于粘稠说明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100μL左右持续添加，直到液体不粘稠为止，呈透亮状态）；

④   转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃长期保存，干冰运输。

 

样本冻存方法：

①   对培养板每个孔中的类器官进行计数，一般一支2ml的冻存管冻存200-300个类器官；

②   去除孔中培养基，加入1ml预冷的含0.1%BSA 的PBS，轻柔吹打3-5次，将 Matrigel从板底吹起并打碎，将悬液移入15ml离心管中；

③   将类器官在4℃，300-500xg离心5分钟，去除上清，加预冷的PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；

④   依据200-300个类器官/500μl冻存液（推荐使用Corning Cat.No.88-702-CB）比例加入相应体积的冻存液；

⑤   轻柔重悬类器官后取500μl转移入耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，标记好直接移入-80℃冰箱，无需冻存盒梯度降温；经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中，干冰运输。

 

上述两种方法二选一即可，建议优先选择样本冻存方法。

 

5. 植物组织采集（不含藻类）

① 选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，植物组织越幼嫩越新鲜所含的次生代谢产物越少，随着植物的逐渐成熟，所含的次生代谢产物产量越来越多，而次生代谢产物会影响RNA的抽提。以草莓的花为例，这么个体量的花，4朵即可，其它花朵样本依此类推；

② （部分样本可选做）迅速用预冷的RNase-Free水配制的1×PBS或生理盐水清洗组织表面的污渍，吸干表面的液体。用剪刀剪切成合适的大小（若非特殊情况，长度最好不要超过2cm）；

③ 处理好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的RNase-Free的耐-192℃低温的螺纹冻存管中，或用标记好名称的锡箔纸包裹好，立即（20s内）置于液氮速冻3-4小时，转移到-80℃长期保存，在RNA提取前避免反复冻融，干冰寄送样本。若在离体后10min未用液氮速冻降温，极有可能引起样本降解。不可直接将样本放入-80℃保存，此时低活性的RNase仍能引起样本降解。

注意事项：

a.植物组织除非为幼嫩的组织，一般不建议RNAlater保存，因为植物组织含有细胞壁及次生壁，RNAlater不易渗透入组织内部；特别是表面有蜡质的植物种植，勿用TriZol直接浸泡植物组织。

b.不允许将植物组织磨成粉寄送。

c.表面含有较多蜡质的植物样本或次生代谢产物含量极高的植物组织或植物组织的茎和根及种子RNA得率通常会较低，为提高RNA的得率需要加大送样量，为普通样本送样量的3-4倍。

d.对于一些需要剥去种皮处理的，因样品速冻后无法准确剔除，如有需要剥去种皮的老师需自行操作。

 

6. 水产类样本采集

① 水产类样本包括淡/海水鱼类、贝类和藻类，其中海水类样本送样前需要进行淡化处理，送样需要选择新鲜采集的样本。

② 大型藻类送样量不少于3g，单细胞藻类送样量不少于1g。

③ 优先选用新鲜采集的样品送样，稀有样本可酌情选取冻存组织。

④ 建议在活体取材后用预冷的生理盐水漂洗干净，去除污渍和血污（软体动物组织建议使用75%的乙醇进行漂洗），在冰上将组织分割成黄豆粒大小的小块（对于刺胞动物，需去除头部和肠道等部位，保留肌肉外壁进行RNA提取），放入干净冻存管中，液氮速冻3小时，-80℃长期保存。

 

7.昆虫类样本采集

① 对于大个昆虫（如毛毛虫），需选取不带肠道部分的组织，分割成黄豆大小的小块；对于较小个体（蚊子、苍蝇、蚂蚁等），应进行适当饥饿处理，建议取6只以上作为一个样品。

② 取样时使用清水清洗表面污渍和微生物，无菌吸水纸吸干表面水渍，放入冻存管中进行液氮速冻，转移至-80℃保存，干冰寄送。

③ 对于蚜虫等微小昆虫类样本，建议取30只以上作为一个样本，使用RNAlater保存，4℃低温保存，冰袋运输即可。

 

8. 外周血/PBMC/骨髓细胞/血清/血浆以及其他体液样本采集（含外泌体分离方法）

 

1.2.8.1 EDTA采血管/真空采血管采集全血方式

（推荐用此类采血管采集全血，性价比高。不允许使用绿色的肝素采血管采集全血，因为肝素会影响PCR酶的逆转录效率）：

① 样本采集前，先用75%的酒精棉由内向四周对采血部位进行消毒；

② 采血至特定的采血管中，数量达到负压允许的最大值；

③ 方法一（首推）：样本采集至EDTA抗凝管后，立即轻柔颠倒混匀10次。动作尽可能平缓。4℃下垂直静置2h后，去除上层血浆，保留下面凝结物质，加入3倍体积的TriZol裂解液，充分裂解后的混合物（裂解液澄清、透亮，上层可能会有少量漂浮物，不影响）转入耐-192℃低温的螺纹口冻存管，液氮速冻1h或者直接放入-80℃冰箱保存，干冰运输。可在-20℃下保存2个月，在-80℃下保存半年，但建议1-2周内尽快提取RNA，以保证获取高质量RNA；

方法二：样本采集至EDTA抗凝管后，立即轻柔颠倒混匀10次。动作尽可能平缓。直接加入三倍以上体积的TriZol（TriZol:血液≥3:1）裂解液混匀，此时出现沉淀为正常情况；混匀完毕后，立刻转入耐-192℃低温的螺纹口冻存管，转入-80℃冰箱保存，干冰运输。建议1-2周内尽快提取RNA，以保证获取高质量RNA。

 

1.2.8.2 外周血中PBMC提取法

 

① 将Ficoll和PBS从低温恢复到室温；

② 向50mL离心管（标记A）中加入10mL Ficoll，随后最好静置一段时间；向另一只50mL离心管（标记B）加入10mL PBS；

③ 稀释：温和摇匀抗凝采血管，用 kimwipes或者消毒纱布移除上盖并放一边，将 10mL血液转移至B离心管，温和混合，获得PBS混合液（20mL）；

④ 适度倾斜离心管A，将20mL PBS 混合液沿壁缓慢加入（注意要缓慢，过快会穿破Ficoll层，极大影响提取效果）；

⑤ 梯度离心：小心地将离心管放入离心机（不要扰动液体层），室温400g 20min离心，加速/减速分别设置为1/0；

⑥ 离心之后小心将其取出，放置于操作台上，可见分为四层，见上图；

⑦ 可选：先移除淋巴细胞层上2-3mm的血浆，方便后面吸取；

⑧ 用P1000移液枪尽可能吸取PBMC细胞，转移至15mL离心管，尽量避免吸取血浆和Ficoll；

⑨ 加入PBS 使体积变为10mL，盖上盖并温和翻转摇匀5次；

⑩ 室温 300g 10min离心，加速/减速分别设置为9/9。去上清并轻弹离心管末端，直至细胞团在剩余PBS中完全重悬。

⑪ 重复步骤⑨-⑩，最后按照TriZol和重悬后的细胞悬液体积约3:1的比例加入TriZol保证充分裂解，裂解标准请参考上面贴壁细胞裂解液处理方式。

 

注意事项：分离PBMC时，ficoll的密度须控制在1.070g/mL，因为如下图所示，单个核细胞分离的密度在1.070g/mL以下；高于此浓度的细胞是多性核细胞。

 

1.2.8.3 骨髓细胞采集

① 一次RNA提取反应所需细胞数≥1×10⁶个，以3×10⁶-1×10⁷个为宜；

② 抽取骨髓液后，200-1000g，4℃下离心 5-10min，得到细胞沉淀弃上清；

③ 加入适量RNase-Free 水配制的1xPBS后，宽口枪头轻柔吹打重悬细胞沉淀，然后在4℃下200g离心5min，弃上清，

重复一次(第二次不弃上清);

④ 离心完成后，从离心机中取出离心管，观察离心后的细胞沉淀，如果细胞沉淀中有红色，准备进行红细胞裂解操作(参

看裂红步骤I，II，ImI)；收集后的细胞沉淀中没有红色，则可以不进行裂红处理，直接进入下一步；

⑤ 加入适量RNase-Free水配制的1xPBS后，宽口枪头轻柔吹打重悬细胞沉淀，然后在4℃下200g离心5min，弃PBS；

⑥ 加入适量 TriZol 裂解液反复吹打至充分裂解，裂解充分标准为吹打后液体不粘稠，无成团细胞块，流动性好。如果液 体过于粘稠说 明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100μL左右，持续添加直到液体不粘稠，呈透亮 状态为止）；

⑦ 转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃长期保存，干冰运输。

 

红细胞裂解操作:

I.步骤④完成后，使用宽口枪头弃上清，加入300ul 1640培养基（含5%FBS）轻轻重悬细胞，后加入红细胞裂解液3mL，置于4℃（冰上），裂红计时3min，如细胞悬液中红细胞较多可以适当延长裂红时间至5min。

II.裂红后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机（12℃，300g，5min）中低温离心收集细胞；如若细胞悬液中还有肉眼可见的红细胞沉淀掺杂其中，可重复步骤I，但裂红时间不可超过5min。

III.裂红完成后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机（12℃，300g，5min）中低温离心收集细胞。

 

联川生物推荐使用BD公司的真空采血管采集全血后分离血清，或使用EDTA紫色抗凝管搜集全血样本以及分离后续的血浆样本。

 

1.2.8.4 血清样本采集

（外泌体适用，采集方法详见“联川生物-外泌体收集及寄送指南”手册（PDF版），外泌体项目推荐miRNA测序和其他RNA的芯片测序）

① 建议使用进口医用血清管或真空采血管等收集全血；

② 上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置；

③ 1800g 10min离心分离得到上层血清样本（全血需在1h内进行血清分离，依据血清管操作说明或客户实验室血清分离步骤进行操作）；

④ 将血清转移至1.5mL离心管中，13000g离心2min；

⑤ 将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中。如果样本体积较大，建议多次分装成小管，无需反复冻融取样。每份分装小样本体积约在100μL（0.1mL）左右。液氮速冻1h后-80℃保存，干冰运输。

 

1.2.8.5 血浆样本采集

（外泌体适用，采集方法详见“联川生物-外泌体收集及寄送指南”手册（PDF版），外泌体项目推荐miRNA测序和其他RNA的芯片测序）

① 建议使用紫色EDTA抗凝管收集全血样本；

② 上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置；

③ 1200g 10min离心分离得到上层血浆样本（全血需在1h内进行血浆分离，依据抗凝管操作说明或客户实验室血浆分离步骤进行操作）；

④ 将血浆转移至1.5mL离心管中，13000 g离心2min；

⑤ 将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中。如果样本体积较大，建议多次分装成小管，无需反复冻融取样。每份分装小样本体积约在100μL（0.1mL）左右。液氮速冻1h后-80℃保存，干冰运输。

注意事项：

a.分离血清血浆应严格按照操作说明进行，操作需在1h内完成，避免出现溶血现象，血清血浆分离后避免反复冻融。

b.血清血浆送样量的原则：越多越好，如果手头上的血清血浆量较少，则有多少就送多少，通常该种类型的样本RNA含量较低，所以需要通过加大样本量以富集足够多的RNA，以保证后续实验的顺利进行，此外血清血浆RNA通常不质检

c.分离血清/血浆样本的全血不可冷冻，混入的血细胞的样本尽量弃尽，已无法使用。

d.血清/血浆的RNA得率为2-8ng/ml，血清/血浆量≥4ml（10-15ml全血分离）。

e.针对血清血浆、细胞上清、外泌体样本，除去miRNA测序，要想获得lncRNA、circRNA、mRNA信息，有两种选择——Smart Pico技术和芯片捕获技术（芯片经常断货，现在已应用较少，不太推荐）。原因有四点：第一，血清血浆或者外泌体样本内的核酸含量极低，需要增加PCR循环数保证建库成功，那必然就会有PCR循环偏好性，导致数据失真。第二，血清血浆或者外泌体样本里的RNA有很多小片段，常规测序方法测出来之后有很多接头序列，数据有效率极低。第三，临床样本外泌体会包裹很多细菌微生物，测出来的数据中有一部分是细菌。第四，lncRNA和circRNA测序中有组装的过程，组装出来的序列长度存在假阳性，跟真实的短片段差距很大，后期验证做PCR时很难P出序列。

而这些测序解决不了的问题，Smart Pico技术和芯片都好解决。1、Smart Pico技术，依托于试剂盒SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian，基于核心技术SMAR^TM技术和Zap R v2 & R-Probes核糖体cDNA去除技术，可以从皮克级总RNA（250 pg–10 ng）中高效制备Illumina测序文库，适用于高品质和部分降解的RNA样本，并能够保留链特异性信息。2、芯片技术，没有PCR 过程，探针很短，适合杂交小片段，探针无法杂交非物种本身的序列。所以Smart Pico技术是外泌体样本RNA类测序的第一选择（外泌体miRNA测序推荐做常规测序），其次可以选择芯片捕 获技术。

 

小贴士——

 

溶血现象解释：即因红细胞细胞膜的破裂而导致的红细胞破碎、血红蛋白溢出的现象。溶血可由多种物理或化学因素引起，尤其在人体外，渗透压的变化、机械外力，温度的变化，酸碱度的变化或血液处理的过程中人为添加的一些化学物质，均有可能引起不同程度的溶血。

溶血应对策略：(1)血液离开人体后，血液环境的稳定性与保存时间的长短呈反比，细胞膜的稳定性也在下降，在这种情况下，应尽快开展血清血浆的分离；(2)不同的抗凝剂有其不同的分子构型，会对血液中各细胞的细胞膜产生不同的作用，有的会增加细胞膜的稳定性，有的会降低细胞膜的稳定性，所以选择一款合适的抗凝剂至关重要（抗凝剂推荐：EDTA、柠檬酸钠）；(3)血液存放过程中温度过高或反复冻融对细胞膜有很大的损害。温度过高及反复冻融会使细胞膜上的结构蛋白构象发生改变，进而造成细胞膜的弹性降低以致破解产生溶血现象，所以用于分离血清血浆的血液应避免反复冻融。

 

1.2.8.6 骨髓、细胞上清液、尿液、唾液、羊水、脑脊液采集（收集上清）

（外泌体适用，采集方法详见“联川生物-外泌体收集及寄送指南”手册（PDF版），外泌体项目推荐miRNA测序和其他RNA的芯片测序）

① 收集骨髓、细胞上清液、新鲜尿液、唾液、羊水、脑脊液（起始量按前面表格中提示），要确保不能溶血（血液中蛋白会污染样品蛋白）；正立置于4°C 或冰盒中，转移至RNase-free离心管。以下操作请在样本收集后1h内进行，以防RNA降解；

② 在4°C条件下离心3000g约10 min，去除细胞及碎片；

③ 将上清小心倾倒入新的RNase-free离心管（注意不要转移沉淀），在4°C条件下离心13000g约2 min，去除残留的碎片及细胞；

④ 转移上清至全新的耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，液氮速冻1h（可选），严密封口。-80°C保存，干冰运输。

注意事项：

a.细胞上清液碎片过多，需充分低速离心多次去除碎片。

b.收集尿液的前一天饮食要清淡，晨起中段尿（临床），晨间1h的尿液（动物）。唾液搜集前需禁食禁烟禁酒2h以上，上午9:30-11:30取样，蒸馏水漱口，将唾液吐于无菌痰杯（保持水浴），勿咳痰，采集唾液时间为30min左右，4℃ 10000rpm 10min，取上清，经0.22μm滤膜过滤除菌。

 

外泌体分离前的各类体液及组织样准备方法，详见“联川生物-外泌体收集及寄送指南”手册（PDF版）。

 

1.2.8.7 外泌体分离推荐方法

（1）试剂盒提取

市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，如SBI外泌体试剂盒，Thermo Fisher的Total Exosome Isolation试剂盒等，可快速便捷地从血液样本中获得高质量外泌体。这些试剂盒不需要特殊设备，提取效率和纯化效果高，受到越来越多研究者的青睐。推荐加拿大Norgen公司的外泌体分离与RNA提取试剂盒。这款试剂盒除了具备操作简单的特点外，能快速纯化富集到与超速离心法一样高质量的外泌体。

 

（2）超速离心法

① 在37 ℃中速融样本。

② 将样本移动至一个新的离心管内，2000 × g，4 ℃，30 min离心。

③ 小心的将上清液移至新的离心管中，10,000 × g，4 ℃，45 min再次离心，以去除较大的囊泡。

④ 取上清，经0.45 μm滤膜过滤，收集过滤液。

⑤ 将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4 ℃，100,000 × g 离心70 min。

⑥ 去除上清，用10 mL预冷的1×PBS重悬后，选择超速转子，再次4 ℃，100,000 ×g，超速离心70 min。

⑦ 去除上清，用100 μL预冷的1×PBS重悬，-80℃冻存。

 

9. 非致病性细菌样本采集

① 一次反应所需细菌的量≤1×10⁷个，以5×10⁶-1×10⁷个为宜。显微镜下观察生长状态，收集对数生长期细菌；

② 将适量体积的菌液转移至2mL旋盖尖底RNase-Free离心管中，室温或4℃下14000g离心4-10min；

③ 弃尽培养基，用无酶水配制的1×PBS重悬一次，3000g离心5min，弃上清收集菌体，将细菌沉淀迅速置于全新的耐

-192℃超低温螺纹口冻存管中，液氮速冻>1h，然后转移至-80℃或液氮中长期保存，干冰运输。

 

10. 非致病性真菌样本采集

一次反应所需真菌的量为50-100mg，将真菌称重，分装多管；将称重后的真菌置于预冷的耐-192℃超低温螺纹冻存管中，迅速投入液氮，速冻时间>3h，转入-80°C长期保存或用干冰直接寄出。

注意事项：

a.请勿寄送真菌培养平板，在低温下也无法保证菌体的生长状态。

 

11. 致病性真菌细菌处理方法

所有可能致病的真菌、细菌RNA项目样品，均需要按下面步骤预处理以后才能寄送至公司，且需要提前通知实验室，明确菌种。（溶液A，B可以向实验室索要。实验室将对未经处理的可能致病的样品，进行销毁处理。）

① 细菌/真菌沉淀（不超过30mg，约绿豆大小）加入400ul溶液A，吹打重悬菌体；

② 在重悬的菌体中加入400ul溶液B，剧烈震荡混匀；

③ 65℃水浴或金属浴加热30min，每隔5min剧烈震荡一次，防止分层；

④ 处理结束以后，-80℃冻存，干冰运输。如为致病菌，请用70%乙醇处理容器表面（注意如处理过程中编号模糊，处理后重新写好编号），确保安全。

注意事项：

a.室温较低时溶液A可能析出沉淀，可65℃预热2-3min待沉淀溶解后混匀使用。

b.溶液B有腐蚀性，使用注意安全操作。溶液B为有机溶液，上层液体为水封，吸取时确保将枪头插入下层液体。

c.溶液A，B不互溶，操作时需要震荡充分，使两种液体形成乳浊液。

d.样品提交单上请注明：样品经过溶液A，溶液B预处理。

 

12. Total RNA样品

Total RNA一般长期保存于-80℃冰箱，若要寄送可直接使用干冰寄出。如果RNA样本中无保存介质，应加入适量保存液，再用干冰运输。

RNA的保存介质（建议浓度≥50ng/μL）：

① RNA保存液（1/10体积3M NaAc，pH=5.2，3倍体积无水乙醇）；

② 3倍体积无水乙醇；

③ RNase-free水（送样量>15μL）。

RNA质量要求：

① RNA纯度：OD260/280值在1.8-2.2之间，无DNA残留。

② RNA完整性：RIN≥7，28S ：18S≥0.7。

③ RNA浓度：＞30 ng/μL

注意事项：

a.Total RNA中应尽量避免多糖、蛋白、DNA等杂质的残留，送样时需注明溶剂成分。

b.Total RNA应避免反复冻融，由于反复冻融所产生的剪切力会对RNA样品有破坏作用，所以在实际操作中，应对RNA样品小量分装。