单细胞转录组测序（10×3’）送样建议

1.实体组织样本采集

1）保存液准备：提前与联川项目经理联系，获取组织保存液（2mL/样本，可根据组织块大小增加）。组织保存液收到后应在4℃条件下保存（效期6个月，有沉淀/冻融后不可使用），切勿冻存。

2）组织量要求：新鲜实体组织（如：癌，癌旁）采集量≥0.2g（参考黄豆粒：0.5cm²大小），具体组织大小参照附件6. 组织重量对照表。*组织较大时，请分割为≤0.5cm²大小的颗粒进行保存运输，防止组织过大无法充分浸润在保护液中。

注意：

l 脂肪组织（含大量脂滴）建议0.5g或以上；

l 肌肉组织（含大量肌纤维）建议0.2g以上；

l 活检穿刺样本，一般建议10号针，穿满1cm以上2-3条（注意：纤维化组织解离成功率低，尽量避免纤维化组织，如含纤维化组织尽量多送，不同穿刺针型号和对应直径大小可参考下表2）。

表.2 穿刺针型号及规格（供参考）

 

3）组织处理：离体组织需进行修剪，剔除非目标附着组织，并利用提前4℃预冷的1×DPBS或生理盐水清洗黏在组织上的血渍，血液含量比较多的组织，如心脏、肝脏等实体组织可进行灌注去除组织血管中血液；

4）组织保存及寄送：无尘纸吸净组织表面的液体，将分割成小块的组织转移至充满预冷组织保存液的螺口冻存管中（应确保所有组织块充分浸润在组织保存液中，如下图1），拧紧管盖防止保存介质漏出，封口膜封口后，于2~8℃保存/运输， 运输采用冷链（2-8℃）/冰袋运输（样本要避免与冰袋直接接触，详细包装方式及要求可见第六章 样本储存与运输标准），切勿使组织冷冻或使用干冰。（请记录并备注好组织名称、组织类型、离体时间、浸入组织保护液的时间，以便后续核对组织保存的全程时间，相关信息请填写至附件5：单细胞样本信息提交单，打印随样本一并寄送）。

 

图.1 组织样本保存液浸润示例

5）特殊物种组织保存：如：海洋生物等生活环境特殊的物种，目前不建议采用组织保存液寄送（海洋生物样本推荐液氮冻存抽核的方式，或者活体运输到公司由客户解剖取样）。

1.1组织样本采集注意事项

1）防止样本干燥：避免组织样本在制备单细胞悬液前干燥脱水损伤，组织样本离体尽快使用提前4℃预冷的1×DPBS、生理盐水或细胞培养基等不含Ca²⁺、Mg²⁺的溶液清洗后，立即充分浸泡于组织保存液中保存；

2）避免热损伤：尽可能避免取样器具对样本造成局部热损伤，由于灼烧而造成的损伤不可挽回。如不可避免的使用激光刀、电刀或其他可能造成组织损伤的手术工具，应尽量剔除热损伤部分，以免对后续实验造成影响；

3）避免化学损伤：应避免消毒试剂或化学物质污染新鲜组织样本，因为新采集的组织样本失去固有保护，容易受外来试剂或化学物质渗透并损伤；

4）避免血液残留：血液含量比较多的组织，如心脏、肝脏等实体组织，在采样时应用1×DPBS或生理盐水反复清洗表面，或者进行灌注去除组织血管中血液，避免血液残留，血液细胞对结果具有重大影响（如红细胞残留严重影响其他细胞的捕获，血液来源的免疫细胞在后续实验操作中无法消除等），只能在取样端消除。

5）实体组织解离 or 抽核会拿到不同的细胞占比

l 解离会得到更多的免疫细胞占比，当然也会拿到内皮、上皮、成纤维等类型细胞。一些大细胞如神经元（脑）、心肌细胞（心脏）、多核化的骨骼肌细胞（老年的肌肉）、成熟脂肪细胞（脂肪）等拿不到或者拿到的很少。

l 抽核会得到更多的实质细胞占比，比如肝实质细胞，肾小球足细胞等，当然也包括上述大细胞。

注意：肝脏样本通过解离的方式拿不到肝实质细胞，即使拿到肝实质细胞占比也非常小，原因是：肝实质细胞酶的耐受性很差，非常容易破裂死亡。因此，如果特别关注肝实质细胞，建议采用抽核的方式。

肝脏解离vs抽核得到的细胞类型比较，请参考以下文献：

Calcagno DM, et al. NOD-like receptor protein 3 activation causes spontaneous inflammation and fibrosis that mimics human NASH. Hepatology. 2022 Sep;76(3):727-741.

Guilliams M, et al. Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily conserved hepatic macrophage niches. Cell. 2022 Jan 20;185(2):379-396.e38.

6）肿瘤样本注意事项

l 手术取样避免热损伤：使用激光刀、电刀或其他可能造成肿瘤组织损伤的手术工具，应尽量剔除热损伤部分（焦黑部分），否则影响组织细胞活率；

l 优先取肿瘤表层区，避免取肿瘤内部组织：当肿瘤病灶进入快速增殖期后，其通过诱导新生血管生成实现营养供给。然而受血管分布异质性及灌注效率限制，肿瘤内部常因血供不足形成缺血微环境，进而引发区域性坏死病理改变。此类缺氧坏死区域的病理特征与肿瘤恶性进展呈显著正相关。若对内部组织进行取样，可能因样本中坏死细胞比例过高导致实验成功率降低。

1.2特殊实体组织（胰腺）样本采集

胰腺组织细胞质量的重要影响因素：患者年龄、基础疾病、病变部位、手术类型及取样时间。因此，在送样前需进行信息收集及售前评估。

患者年龄：小于65岁的患者。65岁以上患者的组织，不建议送样单细胞测序，细胞活性可能较差；

基础疾病：有基础疾病患者的组织，细胞活性也可能下降，需谨慎送样；

取样部位：良性胰腺病变、胰腺囊性病变以及正常胰腺组织。对于肿瘤样本，几乎所有类型的胰腺肿瘤都可送样，包括胰腺导管腺癌（PDAC）、胰腺神经内分泌肿瘤（PNET）、胰腺实性假乳头状肿瘤（SPT）和导管内乳头状粘液性肿瘤（IPMN），囊性病变除外；

手术类型：开放式或腹腔镜胰远端切除术提供的样本较为理想，正常组织可以在远离手术部分的替代点采集，而不会受到任何热或超声损伤；缺血持续时间也影响所获得的细胞数量和活力，建议在血液堵塞和胰腺切片后1小时内切除组织并立即处理。

取样时间：在胰腺切除后1小时内送达实验室开展后续实验，可获得更好的结果。

取样后去除所有血液、筋膜以及坏死的区域，再将组织剪切成5mm以内的小块放入预冷的胰腺专用保存液中，上下颠倒混匀数次，保证组织充分浸润保存液，以避免胰腺分泌物对组织自身造成损伤。

 

图.2 胰腺样本处理示意图

样本运输：将组织置于胰腺保护液中，置于冰上，离体1小时内送到实验室（或上门安排实验）（对于此类样本，需要尽可能缩短样本离体到送达实验室的时间，联川内部实验数据显示，胰腺组织离体时间过长，即使在胰腺专用保存液保存条件下，其组织解离得到的细胞活率仍会显著降低）
温馨提示：胰腺保护液与美天旎保存液成分不同，可提前与销售经理联系，由公司提供。该保存液的长期保存条件为：-20℃保存（保质期3个月），在使用前一天晚上转移到4℃冰箱解冻，待完全融化后使用。

2.液体类样本采集

液体类组织样本需要注意抗凝，低温冻结，细胞活率变化等情况造成的影响 ，可参考以下建议：

1）血液，骨髓类样本需使用EDTA抗凝管（紫盖）（注意：不能用肝素抗凝管），取大于等于2mL 样本量， 取样后充分颠倒混匀，并尽快置于4-8℃保存运输，血液样本尽量在8小时内进行有核细胞分离，运输时间最长不超过12小时（请记录好样本取样、放入抗凝管及4℃保存的时间，以保证及时开展实验）。小鼠骨髓建议取骨头直接置于保存液中4-8℃保存运输，寄送实验室后取骨髓（防止骨髓在送样过程颠簸晃散）（注意：如关注中性粒细胞，请提前告知）；

2）积液类样本，腹水，胸腔积液，膝盖积液，淋巴液等样本，取样后置于4-8℃环境进行运输（建议大于4mL样本量，如达不到4mL，按照最大量收集，根据实际实验的细胞得率决定是否能开展）；

3）尿液样本，50-100mL中段尿，如尿液中含有特殊成分（如：女性尿液中的絮状分泌物）可提前用滤膜或细胞筛进行过滤，取样后置于4-8℃环境进行运输尽快开展实验；

4）鼻腔灌洗液，肺泡灌洗液类样本，体积不好确认（5mL起），如达不到5mL，按照最大量收集，根据实际实验的细胞得率决定是否能开展。若能当天送至联川实验室（4小时内），可直接将灌洗液4-8℃环境进行保存运输；此外，建议把灌洗液收集之后，按灌洗液：DMEM培养基（含10%FBS）=1：3 的比例混合后，4-8℃环境保存运输；或者将灌洗液500g，5min离心收集细胞后加入一定的细胞培养基（如：DMEM，RPMI 1640、MEM、DMEM/F12等），亦可再向其中添加10% FBS 或 2% BSA的血清进行细胞保护后，4-8℃环境保存运输；

5）脑脊液中细胞较为脆弱，获取样本后以最短时间进行处理（杭州实验室或驻地实验室建议取样运输4小时内处理，其他地区建议上门实验）。样本量因不同个体中情况不同，脑脊液中细胞浓度有差异，所以需要老师尽可能多收集样本（案例参考：4mL脑脊液中获取细胞总量1万，最终捕获细胞数3000个左右） 。因为脑脊液总体细胞数量较少，是一类非常特殊的样本，因此在前端需要引导客户，实际能捕获到几百或者小几千个细胞，已经是非常不错的结果。而且建议增加生物学重复，把整体的细胞数量做上去；

3.细胞样本采集

1）细胞起始量：一般要求细胞量至少100万起（后续去死等操作会有细胞损失）；

2）培养的细胞系：培养细胞必须通过镜检观察，判定细胞状态良好且生长密度在80%-90%之间，在细胞培养瓶中装满细胞培养液（不留空气），封口膜封好，根据实验设计，常温或者低温（4-8℃）下尽快送至公司进行质检和标记上机，运输过程中需填充足够多的气泡膜包裹样本，防止震动；

3）组织解离后冻存的细胞：客户解离后的细胞若不能及时（2小时内）送至联川实验室，可按照附件2：细胞梯度冻存程序中所提供的细胞冻存方案，将细胞冻存以后，用干冰寄送至联川实验室。如果老师制备的单细胞悬液质量不高（活率低于85%，细胞总量少于20万）时，则后续复苏实验细胞达标的成功率很低；

4）液体（如：血液、灌洗液、积液等）中分离的细胞：考虑到临床取样的不确定性，对于液体类样本不能及时处理的情况，亦可通过将细胞分离以后按照附件2：细胞梯度冻存程序中所述方案进行细胞冻存后寄送至联川实验室，尽可能提供样本的详细信息（如细胞质量，裂红与否，杂质情况，细胞总量）给到实验人员。

温馨提示：冻存细胞复苏后，细胞活性可能会大幅下降，且可能会损失部分脆弱细胞群，请客户谨慎冻存。培养的细胞优先建议人工寄送，运输过程中避免强烈震动，更详细的步骤可见第六章《样本储存与运输标准》。

4.冻存组织采集

需要抽核的组织样本（如：脑，心脏，肌肉等含有直径大于40μm细胞的组织类型，以及已经长期冷冻保存不能解离获活细胞的珍贵组织），多用于snRNA-seq以及单细胞ATAC-seq实验。

1）组织量：不小于黄豆粒0.2g（0.5cm²）大小的组织（建议至少提供2个黄豆粒大小的组织量，其中一部分用于RNA质检）。

2）样本处理：组织样本采集后，用 4℃ 预冷 的PBS 或生理盐水清洗组织表面血渍，然后用吸水纸吸干表面液体，剪切组织成黄豆粒（0.5-1cm²）大小后，放入冻存管，液氮速冻2小时以上（必需要液氮速冻），继续放在液氮罐或-80℃冰箱冻存。 如条件允许，建议在液氮罐中保存。冻存前，可以将组织分出米粒大小，按相同冻存步骤放入冻存管中液氮速冻，标记为RNA质检样本，和正式样本同时保存。在正式抽核实验前，我们会对质检样本进行RNA提取质检。如果客户没有单独准备，联川生物将会从正式抽核样本中随机取一部分组织进行RNA提取质检，以确保RNA没有发生降解后开始后续细胞核分离实验。

（注：对于组织结构复杂，不同区域细胞类型有明显差异的样本，如脑组织、皮肤组织等，如果客户要求完整组织全部用于抽核，一定要在同批取材冻存时，单独准备一份同样大小同样操作的样本作为RNA质检样本）

3）运输方式：冻存的样本直接采用干冰运输至联川实验室；

 

图.3 冻存组织干冰运输

4）冻存组织避免反复冻融，原则上不接收保存超过3个月的样本进行抽核实验（风险较高）；如果在质检3个月后进行抽核实验，则需要重新质检。针对样本长久保存，但客户对样本保存有信心，需在RNA质检合格的前提下，进行抽核建库；若有降解现象，则不建议进行下游抽核建库实验。

注意：胰腺样本PBS清洗完毕后，建议放在含有RNAlater的冻存管中，4℃保存过夜后，-80℃保存或干冰运输。

温馨提示：

l 从采样到放入液氮中冻存，时间应尽量控制在30min内，以免RNA降解。

l 冻存组织需先进行RNA抽提质检，RIN值合格后进行后续实验，因此，请确保送样量足够，在样本量充足的情况下，建议提供几管备份样本。

5.类器官样本采集

1）样本量

悬液类样本量:大于1×10⁶cells/样；沉淀类样本量：米粒大小（类器官细胞得率低，和培养状态有很大关系，建议尽可能多提供，或进行预实验测试细胞得率）

2）解离样本保存方法

去除基质胶后，置于原本培养环境（直接带培养基），低温运输即可；

温馨提示：类器官解离优先建议人工送至实验室，运输过程中样本与冰袋不能直接接触，避免因为温度过低导致样本冻结，引起组织受损，样本需尽量保持稳定，可使用胶带或橡皮筋将培养皿固定在一个托盘或支架上，增加稳定性，并用保温缓冲材料包裹，防止碰撞和震荡，例如气泡膜、纱布、药棉等。更详细的步骤可见第六章《样本储存与运输标准》。    

3） 抽核样本冻存方法

① 对培养板每个孔中的类器官进行计数，一般一支2mL的冻存管冻存20个以上类器官团；

② 去除孔中培养基，加入1mL预冷的含0.1%BSA 的PBS，轻柔吹打3-5次，将Matrigel从板底吹起并打碎，将悬液移入15mL离心管中；

③ 将类器官在4℃，300-500g离心5分钟，去除上清，加预冷的PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；

④ 转移入耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，标记好后液氮速冻2-3h，移入-80℃冰箱，无需冻存盒梯度降温；

⑤ 经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中。对于抽核样本，保存时间建议不超过3个月，干冰运输。

温馨提示：

l 培养的类器官必须通过镜检观察，判断类器官形态正常、结构完整以及细胞状态良好。

l 需提前确认类器官是否含有支架，如含支架，需提供支架材料的溶解方案或试剂。

6.植物样本采集

目前暂停植物开展原生质体制备的单细胞业务，以植物抽核的业务为主。样本准备如下两种方式：

1）活体植株（优先选择的方式）：条件允许的情况下，我们建议用原始的植物培养条件来寄送活体材料，如盆栽或组培苗形式寄送。为防止土壤散落，盆栽请务必将花盆装满并轻轻压实，土壤保持湿润即可，不可过度浇水，用塑料袋或保鲜膜沿植物基部将土壤与花盆一起包裹固定，并用绳子捆扎好。寄送时，将盆栽或组培瓶正向放置在合适大小的泡沫箱或硬纸箱中，周围空隙用泡沫板或硬纸板固定好，箱盖上用显著标志标示“此面朝上，请勿颠倒”字样，尽量避免运输过程中加花盆颠倒移动或培养基散落的风险（必要情况下，可用木架固定）。寄送温度以样本存活环境为主。

 

图.4 活体植株

2）冻存样本：如果条件不允许的情况下，可以寄送冻存样本。从植物体上取新鲜幼嫩、生长旺盛的根部/叶片/花卉等研究目标组织（组织量尽量达到1g或以上。下图为香草嫩根抽核实验前的称重图片示例），用预冷的ddH₂O反复润洗去除表面泥土等杂质，沾干组织表面液体，放入冻存管中液氮速冻15min以上，干冰寄送。

 

图.5 植物样本称重

注意信息：目前文献中已报到的植物单细胞主要还是集中在拟南芥、水稻、玉米、番茄、花生、烟草、杨树、藻类等物种，组织类型主要集中在根、茎、叶、花等，其中研究最多的是根、茎、叶，而且主要是发育3-7日龄的幼嫩组织。

取新鲜幼嫩的部位开展实验，老组织细胞壁坚硬，难以酶解。新鲜幼嫩部位实验成功率高。