单细胞ATAC项目样本采集
1.实体组织样本采集
单细胞 ATAC-seq 实现了细胞层面的染色质开放区域检测，揭示基因转录的上游调控机制。单细胞 ATAC 实验利用Tn5 转座酶混合液孵育细胞核悬液，转座酶进入细胞核，切割开放染色质区域使DNA片段化，并在DNA片段的末端添加测序引物。影响单细胞ATAC数据质量的一个关键因素是分离出纯净和完整的细胞核，该过程对input细胞核和细胞核内容物的完整性有非常高的要求，避免体系中存在过多ambient DNA。而对于获得纯净和完整的细胞核，实验前期的样本准备方案又是至关重要的因素！
1）组织量：不小于黄豆粒（0.5cm2，大于 200mg）大小的组织。注意：如是脂肪（含脂滴较多），肌肉（含肌纤维较多）等特殊组织，组织量＞500mg
2）样本处理：组织采集后，尽快用预冷 PBS 或生理盐水清洗组织表面血渍，用吸水纸吸干表面液体，剪切组织成黄豆粒（0.5-1cm2）大小后，
l 新鲜组织（优选）：放入螺纹冻存管中，冻存管提前加入 4℃预冷的美天旎组织保存液（2mL/样本，可根据组织块大小增加）；
l 液氮冻存组织（次选）：放入螺纹冻存管中，液氮速冻并长期冻存在液氮中；
l -80℃冻存组织（风险）：放入螺纹冻存管中，液氮速冻半小时以上转-80℃冰箱冻存。冻存时间不超过 3 个月，冻存时间越短，细胞核处理后质量越高，数据质量越好，推荐样本采集后尽快开展实验。
3) 运输方式：
l 新鲜组织：4℃运输至联川实验中
l 冻存组织：干冰运输至联川实验中心
风险提示：
客户准备新鲜组织——风险小；
客户准备液氮冻存组织——风险中；
客户准备-80℃冻存组织——风险高，如超过 3 个月，不建议开展
风险高项目如开展，务必明确好风险情况，需提前垫付款项或其他方式确保不出现商务纠纷！
从以下三个维度我们得出结论，单细胞 ATAC 样本准备优选方式是：新鲜组织 ＞ 液氮冻存组织（长期冻存在液氮中） ＞ -80℃冻存组织（液氮速冻半小 时以上后转置-80℃冰箱冻存）。
维度一，从已发表的单细胞 ATAC 研究文献得出结论
我们下载了 163 篇单细胞 ATAC 研究文献（包括肿瘤学、免疫学、发育生物 学、细胞生物学、神经科学等方向），对组织类型和样本制备方式进行统计。文献统计源表格可扫描以下二维码下载：
图.6 单细胞ATAC文献二维码
按照样本制备方式，分为新鲜样本（解离细胞抽核）、新鲜样本（直接抽核）、 液氮冻存或-80℃冻存样本（抽核）、不明确样本制备方式四种类型，其中
1） 新鲜样本（解离细胞抽核）：90 篇（占比 55.21%）
2）新鲜样本（直接抽核）：10 篇（占比 6.13%）
3）液氮冻存或-80℃冻存样本（抽核）：40 篇（占比 24.54%）
4）不明确样本制备方式：23 篇（占比 14.11%）
表明研究人员主流采用新鲜样本（解离细胞抽核）开展单细胞 ATAC实验拿到高质量数据。
对不同样本制备方式对应的样本属性进行详细分析，90篇新鲜样本（解离细胞抽核）的样本类型为：
1）实体组织：38 篇（占比 42.22%）
2）分选特定细胞：31 篇（占比 34.44%）
3）PBMC：12 篇（占比 13.33%）
4）骨髓：9 篇（占比 10%）
表明实体组织和细胞（分选特定细胞/PBMC）是单细胞ATAC新鲜样本制备的主要组织类型。
10 篇新鲜样本（直接抽核）的样本类型为：
1）实体组织：10 篇（占比 100%）
表明新鲜样本（直接抽核）全部是针对实体组织。
40 篇液氮冻存或-80℃冻存样本（抽核）的样本类型为：
1）实体组织：32 篇（占比 80%）
2）PBMC 或分选特定细胞：8 篇（占比 20%）
表明液氮冻存或-80℃冻存绝大部分是针对实体组织，其余是针对细胞（PBMC/分选特定细胞）。
以上，从文献调研可以看出，相较于冻存样本，新鲜样本是研究人员开展单细胞ATAC实验更优选的样本制备方式。
维度二，从 10x Genomics 官方 support 材料中得出结论
10x Genomics 比较了来自同一个体的新鲜（Fresh）和液氮冻存（Cryopreserved） 的人PBMC的数据，得出以下结论：
1） Cryopreserved 相较于 Fresh PBMC，high-quality fragments per cell 略有降低， 但是 cells 和 non-cells 区分度差别不大，均能看到不错的细胞/非细胞区分（用 于 call cell）；
2） Cryopreserved PBMC 的 ATAC target（fragments overlapping peaks）指标略有 下降，但是数据依然可以使用；
3）Cryopreserved PBMC 显示较高的单核小体 fragments；
4）二者的细胞类型整体差别不大
总体来看，对于人PBMC 这种细胞样本，液氮冻存相较于新鲜的方式，单细胞ATAC指标有些微下降，但是数据是可用的（不过材料中未指示PBMC在液氮中冻存的时间对于结果的影响）。
图.7 人 PBMC 新鲜（Fresh）和液氮冻存（Cryopreserved）数据指标比较
10x Genomics 又比较了 E18 小鼠脑新鲜（Fresh）、液氮冻存（Cryopreserved） 和液氮速冻后-80℃冻存（Flash frozen）三者的数据，得出以下结论：
1） Cryopreserved 与 Fresh ， 在 high-quality fragments per cell ， ATAC target （fragments overlapping peaks），cells 和 non-cells 的区分度等指标均有较好的表现和很高的相似度；
2）Flash frozen 在 ATAC target（fragments overlapping peaks），cells 和 non-cells 的区分度等指标表现均差于其他两种方式，且 call 出来的细胞数也较少
总体来看，对于小鼠脑这种组织样本，液氮速冻后-80℃冻存，要比新鲜和液氮冻存的方式单细胞ATAC指标降低。如果只有液氮速冻后-80℃冻存样本开展单细胞ATAC实验，则应该对部分非核心指标降低标准。
图.8 E18 小鼠脑新鲜（Fresh）、液氮冻存（Cryopreserved）和液氮速冻后-80℃冻存（Flash frozen）数据指标比较
以上结论来源于 10x Genomics support 网页：
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360057278892-How-does-the-data-c ompare-between-fresh-and-frozen-samples-in-the-Multiome-assay
“ How does the data compare between fresh and frozen samples in the Multiome assay? ”（新鲜和冻存样本的 Multiome（单细胞 ATAC+mRNA）检测的数据差别是什么？）
维度三，从实测数据中得出结论
我们实测了7 例小鼠主动脉血管新鲜样本，采用解离后细胞抽核开展单细胞ATAC实验，从以下 5 个指标看均有非常好的表现！
图.9 7例新鲜样本解离后抽核单细胞ATAC数据指标
此外，实测了 2 例小鼠心脏-80℃冻存抽核开展单细胞 ATAC 实验，5 个指标合格，但不及上述新鲜样本的指标表现。3 例人心脏瓣膜和 1 例人食管-80℃冻存 （冻存时间超过半年）抽核单细胞 ATAC 实验数据显示，Fraction of transposition events in peaks in cells、TSS enrichment score、Fraction of high-quality fragments over lapping peaks均有所降低。
图.10 6例-80℃冻存样本抽核单细胞ATAC数据指标
综合以上三个维度的结论，单细胞 ATAC 样本准备最优方案是新鲜组织（优选），其次是液氮长期冻存组织（次选）。
-80℃冻存组织（液氮速冻半小时以上后转至-80℃冰箱冻存）方式是存在风险的，如冻存时间超过3个月，不建议开展！
2.细胞样本采集
1）细胞量：推荐100 万（最少不低于 30 万，且存在风险），细胞状态良好，杂质含量低无污染，细胞活率好（活率>90%，若活率<80%，则去除死细胞和细胞碎片）；
2）新鲜细胞：细胞培养于培养瓶中，在运输前灌满培养基，室温运输；
3）冻存细胞：细胞用 PBS 洗涤，4℃ 300g 离心 5min，小心吸去全部液体后，使用细胞冻存液梯度冻存（附件2. 细胞梯度冻存程序）。加入冻存液，使用程序降温盒控制冷冻的速率，以减少细胞的损失。将细胞冻存在-80ºC 冰箱，后续转移到液氮或-150ºC 冷冻室进行长期储存。细胞冻存在-80ºC 的时间越长，解冻后细胞活力下降的风险就越高。
3.中性粒细胞影响
活化的中性粒细胞可以参与 NETosis，在该过程中形成中性粒细胞胞外陷阱(NET)，即捕获病原体的蛋白质和染色质复合物。在NETosis 期间，中性粒细胞染色质膨胀，其中染色质解凝并最终冲出细胞。NETosis会导致中性粒细胞裂解，体系中存在大量非组织特异性开放染色质，单核小体片段增加，带来非常高的背景数据，致使ATAC数据质量严重下降。因此像骨髓，肺（炎症模型），小肠（炎症模型）等富含中性粒细胞的组织，需要将组织先解离成细胞悬液，通过流式细胞仪或免疫磁珠等方式去除中性粒细胞之后再开展抽核实验。原则上对于中性粒细胞占比超过5%的样本，需要去除中性粒细胞（*重要），避免后续出现因为中性粒细胞的影响导致数据不可用的情况。
单细胞ATAC实验，或者单细胞ATAC+单细胞转录组实验，需要进行提核处理，常用提核方法：①组织消化制备细胞悬液提核；②组织直接提核。若需要去除中性粒细胞，需要先将组织制备成单细胞悬液，然后用磁珠或者流式分选去除中性粒；不需要分选的组织可以直接提核；冻存组织直接提核。
表.3 样本量和实验建议
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中性粒＜5% |
5%＜中性粒＜20% |
中性粒＞20% |
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新鲜细胞 |
106 个 |
3*106 个 |
建议预实验，判断样本量和可行性 |
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新鲜组织 |
200mg |
600mg |
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冻存组织 |
400mg |
不接样 |
不接样 |
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是否去除中性粒细胞 |
不去除 |
去除 |
去除 |