ATAC-seq样本送样指南
1细胞样本采集
1)细胞培养类型及要求
细胞起始量：一般要求冻存细胞10万（1×105以上）及以上，复苏后开展实验。建议分管冻存，每管2-5万个细胞。细胞可来自于原代细胞、培养细胞或组织解离后的单细胞悬液。冻存前请进行细胞活力质控，细胞活率大于80%为最低要求，建议达到90%以上为佳，有核率大于70%，无明显杂质。如未达到要求，请提前与实验工程师确认。
l 贴壁细胞：显微镜下检查细胞，确保细胞生长良好且无污染。将贴壁细胞用胰酶消化方法制备细胞悬液，尽量去除细胞团/碎片/杂质等。
l 悬浮细胞：显微镜下确定细胞生长状态良好且无污染。
l 原代细胞、经流式分选等初始活性较低或细胞量过少的样本，需评估。
注意事项：ATAC-seq/CUT&Tag等涉及Tn5酶的项目被支原体污染后对数据结果影响极大，因此在收集细胞时须进行支原体检测，保障样品无支原体污染。
2)送样提示
l 新鲜细胞可以根据实验设计的可行性，通过常温或者低温（2-8℃）提交样本至公司，但考虑时效性，仅限公司所在地杭州。
l 冻存细胞样本，以干冰寄送至实验室，实验人员复苏后进行ATAC-seq实验。
细胞冻存方法：建议采用冻存液，以程序性降温方式进行。将细胞重悬至冻存管的冻存液中，随后转移至置于程序性降温盒内，将程序降温盒置于-80℃冰箱，盒内温度线性下降，最大程度保持细胞活性。
提示：样品活性越高，数据质量越好，因此保障细胞活性的措施均有助于本项目质量保障。
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2临床组织或动物组织采集
实体组织样本采集建议剔除坏死损伤组织，非目标组织，清洗组织表面血渍。参考以下建议保存和送样：
1)冻存组织——优先推荐
取下新鲜组织，当组织体积较大时，在冰上将其切成小块或黄豆粒（0.5-1cm2）大小。组织采用预冷的1×PBS溶液洗掉组织表面残留的血液，并采用吸水纸吸取表面水分。水分或血液残留将影响组织冻存后核酸完整性，可能影响本项目质量。将处理好的组织样本保存在2mL或更大体积的旋盖冻存管中。迅速置于液氮中速冻30min，然后转移至-80℃冰箱中保存，置于密封性良好的自封袋中，干冰运输。
提示：样品冻存时间越短，细胞核处理后质量越高，数据质量越高，建议样本采集后尽快开展实验。
冻存组织制备注意事项：
a) 避免样本表面水分或血液残留：组织采用预冷的1×PBS溶液洗掉组织表面残留的血液后，采用吸水纸吸取表面残留液体。水分或血液残留将影响组织冻存后核酸完整性，可能影响本项目质量。
b) 防止样本过于干燥：组织样本在冻存前过于干燥脱水损伤，组织样本离体尽快处理冻存。
c) 组织速冻：请以液氮速冻，请勿直接将新鲜组织直接置于-80℃冰箱内。
2)新鲜组织
新鲜组织样本也可置于Miltenyi样本保存液中，送至公司进行提核获取细胞核，但对时效性要求极高，优先建议以冻存组织进行。组织放入在1.5mL或2mL装有组织保存液（也可以临时用胎牛血清或培养基替代）的保存管（样本保存液保存温度为2-8℃）中，每份质量需要大于100mg。取样后置于2-8℃环境保存，48h内寄送到公司。
新鲜组织采集注意事项：
a) 防止样本干燥：避免组织样本在制备单细胞悬液前干燥脱水损伤，组织样本离体尽快使用提前4℃预冷的1×DPBS或生理盐水，或细胞培养基溶液清洗后，立即置于组织保存液中。
b) 避免热损伤：尽可能避免取样器具对样本造成局部热损伤，由于灼烧而造成的损伤不可挽回。如不可避免的使用激光刀、电刀或其他可能造成组织损伤的手术工具，应尽量剔除热损伤部分，以免对后续试验造成影响。
c) 避免化学损伤：应避免消毒试剂或化学物质污染新鲜组织样本，因为新采集的组织样本失去固有保护，容易受外来试剂或化学物质渗透并损伤。
d) 取肿瘤表层区，避免取肿瘤内部组织：当肿瘤病灶生长速度加快后，需诱导机体生成血管，供应其营养。由于营养供应程度有限，不能够满足肿瘤细胞的过度增殖，在肿瘤内部血液供应较少处容易发生缺血、坏死，也说明该肿瘤恶性程度相对较高。取内部组织会出现细胞活率低的问题。
e) 组织样本勿使用RNALater、TRIzol、酒精保存。
f) 结缔组织、脂肪组织、骨骼、血液、皮肤、毛发等特殊组织部位，需评估。
3类器官样本采集
1)对培养板每个孔中的类器官进行计数，一般一支2mL的冻存管冻存200-300个类器官；
2)去除孔中培养基，加入1mL预冷的含0.1%BSA的PBS，轻柔吹打3-5次，将Matrigel从板底吹起并打碎，将悬液移入15ml离心管中；
3)将类器官在4℃，300-500g离心5分钟，去除上清，加预冷的PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；
4)依据200-300个类器官/500µL冻存液（推荐使用Corning Cat.No.88-702-CB）比例加入相应体积的冻存液；
5)轻柔重悬类器官后取500µL转移入耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，标记好直接移入-80℃冰箱，无需冻存盒梯度降温；经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中，干冰运输。
4植物样本采集
目前公司还未开展植物原生质体制备业务，植物以抽核为主。样本准备如下两种方式：
1)条件允许的情况下，建议用原始的植物培养条件来寄送活体材料，如盆栽或组培苗形式寄送---优先选择的方式。
2) 如果条件不允许，可寄送冻存样本。从植物体上取新鲜幼嫩、生长旺盛的根部/叶片/花卉等研究目标组织，液氮速冻，以干冰寄送。组织量的要求：组织量尽量达到1g或以上。以下是香草嫩根抽核实验前的称重图片示例（1.3g）。
图、上图植物新鲜活体材料；下图香草嫩根寄送组织称重。
提示：植物的抽核主要是发育3-7日龄的幼嫩组织。新鲜幼嫩部位实验成功率高，老组织细胞壁坚硬，难以酶解。建议取新鲜幼嫩的部位开展实验。
5其他类样本采集
如果老师待处理样本，在上述常规介绍中未有提及，老师可联系技术进行专属方案制定，我们为您提供方案。
注意事项及可能影响ATAC项目数据质量的关键点：
1)保证样品没有支原体污染。样本一旦有支原体污染，数据损耗会非常严重，因为支原体DNA无蛋白保护，Tn5酶会偏向酶切支原体DNA，而不是有蛋白保护的真核DNA，强烈建议客户在取样时，同时进行衣原体检测（样品到达公司以后再检测，且会影响样品活性，进而影响最终数据质量）。
2)细胞器的残留。与支原体污染类似，细胞器DNA没有保护，如果不将细胞/组织中的细胞器除掉，细胞器DNA占比会非常大，即使已发表的文章都存在这个问题，在抽核的基础上进行流式分选，可以部分去除部分线粒体污染。
3) 通透性及代谢产物。样本异质性包括通透性及其代谢产物的影响，将干扰Tn5酶进入细胞和细胞核的机会，以及进入后的酶切效率，这些将可能导致信息不全和丢失。
4)细胞类样品活性。与单细胞测序一样，细胞活性至少要80%以上才能进行下游实验，当样品活性偏低时，结合在蛋白上的DNA会跟DNA脱落，从而失去蛋白的保护，而Tn5酶更容易酶切无蛋白保护的DNA，且切割无序，因此将导致背景杂音非常大，可能缺失single nucleosome、Dimer、Trimer等典型特征。当取细胞核进行ATAC实验时，主要关注细胞核数量与细胞核核型。
细胞核型质控，A、B为佳