功能基因多样性测序样本送样建议
1.土壤的微生物实验样本采集
1.1土壤采样前期准备之器具准备
为了采样顺利开展，请提前准备好以下采样器具以及其他所需材料。采样工具和盛放土壤样本的容器必须提前灭菌（锡 箔纸包裹，高压蒸汽灭菌后，120 ℃烘箱过夜），避免外源物质干扰。
1.2采样位置选择
根据研究目的，进行采样点的选择，采样点的选择应遵循以下原则：
A. 采样点土壤类型特征明确，地形相对平坦、稳定，植被良好。
B. 坡脚、洼地等具有从属景观特征的地点不宜设置采样点。
C. 城镇、住宅、围墙、道路、沟渠、田埂、粪坑、堆肥点、坟墓等地人为干扰大，可能造成土壤特性错乱，使土壤失去代 表性，不易设置采样点。
D. 采样点离铁路、公路至少 300 m 以上。
E. 采样点以剖面发育完整、层次较清楚、无侵入体为准，不在水土流失严重或者表土被破坏处设采样点。
F. 不在多种土类、多种母质交错分布、面积较小的边缘地区布设采样点。
注意事项：确定采样点后可以使用精准地图或者GPS 进行采样点定位，或者在采样点进行标记，便于以后重复取样或者进行比较试验。
1.3取样方法设置
注意！同一次实验，同一种方法。
A．土壤横向取样方法示意图：
B．土壤纵向取样方法示意图：
1.4 普通土壤
1) 去除土壤上面的覆盖物，包括植物、苔藓、可见根系、凋落物以及可见的土壤动物等。
2) 对采样器使用酒精棉擦拭，待酒精挥发完全后，可使用采样样方处土壤浸润采样器。后续每次更换样方均需重复此步骤。
3) 同一样方多点混合取样（建议 3-5 个点等量混合），去除样本中的植物、可见动物以及石粒等，然后根据土壤情况，选 择是否过筛，
1、 推荐过 2 mm 筛；
2、 一些有机质（如粗腐殖质或泥炭等）不能通过 2 mm 筛，此时可以选择过 4-5 mm 筛；
3、 如果土壤粘度太大或者含水量太高，可以选择不过筛。
4) 将混合好的土壤样本，分装多份，每份3-5 g，液氮速冻（如果条件不允许，可以选择放在冰盒中，尽快运回实验室）， 随后转移至-80 ℃冰箱保存，用于测定土壤微生物；另外留出一部分土壤，用于测定土壤理化指标（如有机质、全氮、 矿质元素等）。
1.5 根际土壤
1.5.1作物类（草地等矮小植物）根际土壤
1) 采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室。
2) 晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤。
3) 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻 1 h 以上，置于-80 ℃冰箱保存。
1.5.2林木类根际土壤
1) 采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室。
2) 过2-5 mm 孔径无菌筛网。
3) 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻 1 h 以上，置于-80 ℃冰箱保存。
1.6活性污泥/沉积物类
同一活性污泥装置，进行多点取样并等量均匀混合至约 10 mL 的悬浮污泥样本或5-10 g 沉降物，保存无菌冻存管，液 氮速冻或冰/干冰避光运回实验室，置于-80 ℃保存。若液态污泥样本沉降物较少，需加大取样量。
1.7水体/地表沉积物
主要包括城市、河流、管道污泥，海底、江河、湖泊、冰川等环境沉积物。使用重力取样器取距离
水底/地表 0-10 cm（具体按实验目的而定）沉积物（底泥）5-10 g，保存无菌冻存管中，液氮速冻或冰/干冰避光运回实验室，置于-80 ℃保存。
1.8岩石、砂砾类岩石
1) 取 10 根经无菌水湿润的消毒棉签，擦拭岩石表面，面积约35cm2，保留拭子放入无菌离心管（可事先装入 6 mL无菌水），置于冰上运送至实验室。
2) 将样本超声 20s，接着涡旋 1 min，再超声 20 s，无菌移除拭子，18000 ×g 离心 10 min，去上清，收集沉淀，进行 DNA 提取。拭子数量和擦拭面积可依实际情况酌情增减。
注意事项：采集其他体积较大的样本表面微生物均可参考此方法。
1.9沙石
1) 无菌采集沙石样本保存无菌袋或冻存管中，置于冰上运送至实验室。
2) 使用 50 mL 无菌水浸没沙石，大力晃动数秒（或低速离心孵育一定时间），收集液体，使用0.22 μm 孔径滤膜过滤，将 滤膜样本置于无菌冻存管中，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。
3) 注意事项：采集颗粒类样本表面微生物均可参考方法。
2水体的微生物实验样本采集
2.1水体采样器具准备
为了采样顺利开展，请提前准备好以下采样器具以及其他所需材料。采样工具和盛放水体样本的容器必须提前灭菌（如 锡箔纸包裹，高压蒸汽灭菌后，120 ℃烘箱过夜），避免外源物质干扰。
a)普通采样器：在进行河、湖或者是海洋等表层水体采样时，可以使用处理后的塑料瓶即可。
b)排空式采样器：一种手动简便易行的采样器，该采样器可以沉入预定的深度进行特定深度水体样本的采集 。
c)多通道综合深度采样器：此类设备可以用于深海水体样本的采集，保证水体样本微生物群落结构的稳定。
2.2采样容器洗涤
1) 容器洗涤：将容器用水和洗涤剂清洗除灰尘、油污后，用自来水冲洗干净，再用 10%的硝酸或盐酸浸泡8h，取出后用自来水冲洗 3 次，最后用蒸馏水充分淋洗干净。
2) 容器灭菌：高温高压灭菌，并及时烘干容器；如果无法灭菌，可以使用 75%酒精和无菌水反复冲洗。
注意事项：处理后的容器应在 2周内使用；更换样地进行样本采集前，使用酒精对仪器设备进行消毒灭菌处理，或者使用样 地水体对仪器设备进行润洗。
2.3水体取样方案
1) 样本采集：水体的取样深度和范围可以根据实验目的进行确定选择，并采用相应的采样器进行样本采集。
2) 样本处理：根据实验设置，选取适当孔径的滤膜（常用0.22μm孔径），使用水体抽滤机抽滤 1~100 L 水体（不同水质间差异极大，根据水质选择抽滤体积），或抽滤 至滤膜上可见明显覆盖物。收集滤膜进行 DNA 提取或置于-80 ℃冰箱保存。
注意事项：根据水体中微生物含量，依据项目经验，污水等菌群丰富的水体用量一般为200-1000 mL，湖泊、河流等自然水体一般为 1-2 L，自来水等菌群含量较低的水体则一般为 1-5 L，甚至更多。如果体积超过 2mL，且细菌含量较低，需要全部上样提取，则不可直接冻存后送公司，因为冻融过程中液体里的细菌极可能破裂，到公司后通过离心或者过膜收集菌体时已 经无法收集到已经破裂的菌体。正确的处理方法是在样品冻融前进行离心或过膜处理，将滤膜或者离心得到的沉淀送到公司。
2.4滤膜选择
滤膜孔径大小选择（不同材料有不同的界定，下述数据仅供参考）
Ø 0.22 μm 适用于细菌/病毒。
Ø 0.8 to 5 μm 适用于超 微浮 游 生物 （ Piconanoplankton）。
Ø 5 to 20 μm 适用于微型浮游生物（Nanoplankton）。
Ø 20 to 180 μm 适用于小型浮游生物（Microplankton）。
Ø 180 to 2000 μm 适用于中型浮游生物（Mesoplankton）。
2.5抽滤操作
通常情况下，对环境水体微生物进行检测之前，需要通过抽滤装置对水体样本中的微生物进行富集，具体抽滤装置如上 图。抽滤时，先将真空泵打开，然后将环境水体倒入，当滤膜表面有可见覆盖物后，可以停止加样。抽滤结束后，先拔掉抽 滤管，再关闭抽滤泵，防止倒吸。用镊子将滤膜取出，放入冻存管中，保存于-80 ℃冰箱，尽量使用 1 张滤膜进行样本富集。
2.6离心处理
1) 通常情况下，环境水体样本的富集推荐使用真空抽滤的方法，如果样本浑浊度很大或者没有抽滤装置，可以考虑使用离 心的方法进行富集。此方法只作为备选方法，不推荐使用。
2) 水体样本浑浊度较大的情况下，可以使用小型离心管，离心 2-6 mL 样本后送沉淀物（管底要有一定量的沉淀物），13000 g 离心 5-10 min。
3) 水体比较澄清的情况下，需要加大离心的样本量，这时可以使用大离心管，离心50-100 mL 甚至更多体积的样本，送 样标准依然是以底部有一定量的可见沉淀物为准。通常大型离心机的转速不是很高，可以适当的增加离心的时间。
3发酵液
1) 对于水质较为混浊的（微生物含量较为丰富的发酵液）水体，三点取样混合摇匀。
2) 取8-10mL 分装至两个耐-192℃超低温的无菌 5mL 离心管中，每个分装 4mL（注意不要分装过满，防止水样冻存体积膨胀致使离心管破裂，被其他微生物污染）。
3) 液氮速冻，-80℃保存。
4 气体的微生物实验样本采集
1) 对于空气样本采集，建议使用专门的空气收集仪器，使用时注意对专用采样仪器的进样头、切割头和膜托等关键部位进行清洗。
2) 空气收集仪器的采样模式大概分为两种，一种是无菌滤膜收集方法，另一种是液体撞击式收集方法：
无菌滤膜收集方法：可将无菌滤膜置于采样器中（滤膜材质为玻璃纤维，直径 80 mm），空气流量为 1 L/min，收集1-2h。
液体撞击收集方法：建议用无菌水或者PBS 缓冲液作为样本吸附液，收集完后，对含有空气微生物的吸附液进行 离心或者过滤浓缩的方法提取DNA即可。
3) 对于无菌滤膜收集方法，可以通过寄送滤膜的形式将收集的空气微生物样本运往公司，运输途中建议干冰寄送，干冰需要5-10 kg；
4) 对于液体撞击收集方法，将吸附液过滤后的滤膜寄送，过滤的步骤可以参照灌溉水样的样本采集流程；样本运输建议干冰寄送，干冰需要 5-10 kg。
5 辅助材料
5.1 致病细菌灭活和收集（用于 DNA 项目）
1) 菌液体培养物混匀，取3ml 入 15ml 离心管，加入 7ml 无水乙醇混匀（至乙醇终浓度为 70%）室温处理 2 小时。
2) 4500g 离心 10min，沉淀菌体，弃上清。
3) 加入1-1.5ml 无菌 PBS 或生理盐水重悬，转移至 1.5ml 离心管，8000g 离心，10min，弃上清。
4) 再加入1ml 无菌 PBS 或生理盐水重悬，再次 8000g 离心，10min，弃上清。
5) 沉淀可进行DNA 提取实验，或冷冻保存。
注意：上述体积可根据实际情况调整，需要注意的是，不论体积如何，加入乙醇使终浓度 70%-75%，加入的菌 PBS 或生理 盐水的作用是去除残余的乙醇，可增大体积或增加洗涤次数。
5.2 致病菌灭活和收集（用于 RNA 项目）
细菌真菌 RNA 提取有独特的方法，如客户需要，实验室可以通过销售或项目管理申请，向客户提 供两种试剂（溶液 A，溶液 B），对致病菌样品进行预处理。该步骤仅适用于做 RNA 项目的样品。
处理流程主要包括：
8000g 离心 10min 收集菌体（约 10-50mg，不超过半颗黄豆大小，如超过，则需要增加加入溶 液量）。
加入500μL 溶液 A 重悬。
加入 500μL 溶液 B，剧烈震荡混匀，（AB 不互溶需要剧烈震荡为乳浊液，防止分层）。
-80℃ 保存，干冰运输。
5.3 土壤 RNA 样品预处理
5.3.1一般土壤
不同地域土壤，极低海拔或高海拔地区；不同处理土壤，如追肥、足灌、耕作方式、污染程度等；根系及非根系土壤，研究根际及非根际，根表及根内微生物等。
取样方法
（1）采样所用工具或其他物品都要事先灭菌，或用采取的土壤擦拭。
（2）取5-10 cm处普通土壤，针对际土壤，需采集20 cm深的土壤于50mL的无菌管里，多点采取重量相当的土壤进行混匀，去除杂质后再取一定量土壤装入无菌管，每个样品取样2-10g，迅速放在液氮里冻存。
（3）密封后用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
注意事项：为防止交叉污染，不建议使用自封袋取样。
5.3.2 污泥样本
不同类型污泥，如水池、沼气池、生物电池等；不同处理污泥，如地域、深度、污染程度等。
取样方法
（1）活性污泥样本取自活性污泥装置中，一般取样量大于20ml，将其置于无菌管中，建议立即提取后-80℃保存。
（2）海洋沉积样本根据研究目的进行取样，一般建议取50g 以上的沉积物装入冻存管中，低温运输并尽快进行提取-80℃保存。
注意事项：活性污泥样本等一般建议及时提取，样本体积较大，长时间-80℃保存，主要是冻融提取比较困难，加大了实验工作量及难度。建议提取后保存RNA即可。
针对固体样品可以直接冻存送样。建议使用RNA保护剂保存，具体方法如下：
（1）每克土壤加入2~2.5倍体积保护液，如1g土壤中加入2~2.5 ml保护液。注意：若对象是底泥沉积物样品，每克湿重样品请加3倍体积保护液。
（2）涡旋或手工摇匀，使样品与溶液混匀，保护液液面应当高于土样层。根据情况-20℃、4℃或室温保存。
（3）提取样本RNA时，2500×g离心5min，移除Tube管中的保护液，收集土样。
备注：常用保护液为LifeGuardTM Soil Preservation Solution或RNAprotect Bacteria Reagent。
5.3.3 水体样本
不同类型，如海水、污水、养殖水等水体；
不同处理，如处理时间、深度、受污染程度等水体。
取样方法
（1）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45 μm的滤膜，取样体积大于5L。
（2）对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤。
（3）将滤膜冻干后，用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。