微生物群落多样性(16S/ITS测序)样本送样指南
微生物群落多样性(16S/ITS测序)样本送样指南
a) 本 指南 中 的方 法 和建 议 绝大 部 分适 用 于以 DNA为 检测 对 象的 16S/ITS扩 增子 测 序和 宏 基因 组 测序 等;
b) 由 于样 本 采集 方 法不 是 唯一 的 ，本 指南 提 供为 一 般性 方 法 。如 您使 用 的方 法 已被 证 明有 效 或是 您 希望 参 照所 研 究 领域 的 文献 方 法， 您 可以 使 用那 些 方法 进 行取 样 ;
c) 特 别注 意 ，样 本寄 送 过多 或 过少 都 不利 于 实验 正 常开 展，请 参照 指 南要 求 的量 提 供,如 有疑 问 可 询问 我 方人 员;
d) 如 样本 需 同时 进 行其 他 检测（如 代谢 组 检测 ），请 参照 相 关项 目 的要 求 采集 和 保存 样 本。不 同检 测 项目 的 样本需 分开 保 存于 独 立的 样 本保 存 管中;
e) 采样过程应尽量避免对样本的干扰，缩短保存和运输时间，使样本尽可能代表自然状态下的微生物原貌;
f) 样本采集后，请尽快将样本置于-80 ℃保存或液氮速冻保存，或马上进行样本 DNA 抽提，避免样本储存不当影响实验结果；
g) 不接收含病原微生物的人源样本（如传染病人的肠道来源样本），或是含有可传人病原微生物的哺乳动物来源的样本，或是无法判断是否有危害的样本，但可以接收病原微生物或上述样本提取的 DNA 样本，或是已做灭活处理的致病菌样本；（致病菌灭活操作请见附件）
h) 整个样本采集过程，都须遵守无菌操作。
常见组织样本微生物组学最低起始量（仅供参考）
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样本类型 |
扩增子测序（16S/ITS 等） |
宏基因组测序 |
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粪便（人/牛/羊/鸡/鸭） |
50-100mg |
100-300mg |
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粪便（小鼠等小型动物） |
50-100mg（2-3 粒） |
100-300mg（3-5 粒） |
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肠道内容物（人/牛/羊/鸡/鸭） |
100-300mg |
100-300mg |
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肠道内容物（小鼠等小型动物） |
50-100mg |
100-200mg |
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肠道内容物（鱼虾昆虫等） |
50mg |
50mg |
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唾液样本 |
2-5mL |
不推荐 |
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阴道或子宫等生殖器官样本 |
擦拭纸/棉拭子 2-3 根 |
不推荐 |
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口腔样本 |
擦拭纸/棉拭子 2-3 根 |
不推荐 |
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皮肤样本 |
擦拭纸/棉拭子 5-6 根 |
不推荐 |
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瘤胃液（按含菌量丰富程度而定） |
10-15mL |
20-30mL |
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植物表面菌 |
用 无菌 水 清洗 选 定部 位，滤 膜 1~2张 |
不推荐 |
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普通土壤/根际土壤 |
3-5g（ 可留 多 份备 用 ） |
3-5g（ 可留 多 份备 用 ） |
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根际土壤 |
3-5g（ 可留 多 份备 用 ） |
3-5g（ 可留 多 份备 用 ） |
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活性淤泥 |
5-10g 沉 淀物 （ 可留 多 份备 用 ） |
5-10g 沉 淀物 （ 可留 多 份备 用 ） |
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岩石沙砾砂石 |
>10g |
>10g |
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污水样本 |
1-2 张 滤膜/高速离心沉淀物 |
1-2 张 滤膜/高速离心沉淀物 |
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湖泊河流海洋自然环境水体样本 |
1-2 张 滤膜/高速离心沉淀物 |
1-2 张 滤膜/高速离心沉淀物 |
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自来水等菌群较少水体样本 |
1-2 张 滤膜/高速离心沉淀物 |
1-2 张 滤膜/高速离心沉淀物 |
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气体样本 |
详 见气 体 微生 物 实验 样 本采 集 章节 |
详 见气 体 微生 物 实验 样 本采 集 章节 |
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发酵液（按菌群丰富程度） |
5-10mL |
10-20mL |
DNA样本送样指南：
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项目类型 |
样本起始量 |
样本浓度（Qubit） |
样本体积 |
样本纯度 |
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扩增子测序 |
>50ng qubit 定量 |
>10ng/μL |
>20μL |
1.8≤OD260/280≤2.0、1.5≤OD260/230≤2.0 样本无色透明不粘稠，电泳主带完整，无弥散或拖尾 |
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宏基因组测序 |
>1μg qubit 定量 |
>50ng/μL |
>20μL |
1.人体微生物样本采集
注意事项：
在采样前，请根据既往的课题经验或是文献中的标准，确定受试对象的纳入与排除的具体标准，以及采集条件
（如采样部位、样本类型、采集时间等）；
采样前，在采样管（如 2mL 螺口冻存管）及自封袋上用油性笔注明取样对象信息（如姓名、样本编号、样本
型、取 时间等）；
保证所用材料和试剂均为无菌状态；
取样过程中应保持无菌，隔绝被污染的机会；
同一研究所有样本的采样方法、采样部位、采样时间需保持一致，且样本一式多份保存，避免反复冻融。
1.1 肠道样本
1.1.1 成年人粪便
1) 在收集粪便样本前将尿液排尽，避免尿液污染粪便。将无菌粪便收集盒（或其他无菌收集器）放入蹲式（或坐式）马桶后排便，确保粪便排入盒中。
2) 将手洗干净或戴上无菌手套，拧开 2 mL 无菌冻存管盖，将灭菌棉签的棉头插入粪便中，并轻微搅动。
注意！因粪便表层含有肠粘膜脱落细胞，而外部容易污染，且接触空气后，部分细菌 DNA 开始降解，所以取样时应取中段内部的粪便样本。
3) 用棉签取黄豆大小（约 50 mg）样本放入螺口冻存管，取出棉签，旋紧冻存管盖。一式三管。如用于宏基因组测序， 以及其他项目检测，建议取样5~10 管。
4) 将冻存管放入自封袋中，并封紧，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4h）送至实验室进行DNA抽提或-80℃保存，防止反复冻融。
1.1.2 婴儿粪便
1) 在收集粪便样本前将尿液排尽，避免尿液污染粪便。
2) 带一次性无菌手套，将新鲜粪便收集到无菌粪盒里，或采用润滑的无菌医用拭子对会阴部刺激促进排便。然后用无菌棉签挑取粪便至无菌螺口冻存管，一式三份，每份 100mg。
3) 将冻存管放入自封袋中，并封紧，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80℃保存。防止反复冻融。
1.1.3人体肠道组织样本（内部菌）
1) 用灭菌剪刀、解剖刀切取相关部位指甲盖（1cm2）大小左右组织块。组织表面如有污浊物或是血，请用预冷的无菌 PBS 快速清洗 2 次，吸干。
2) 将组织块放入无菌螺口冻存管中并旋紧盖子，置入液氮速冻 1 小时后，转入-80℃冰箱保存。
1.1.4肠道灌洗液
1) 将肠道灌洗液低速离心（200-500 g 离心5 min）收集上清液，将上清液过 0.22 μm 可拆卸的滤膜，收集滤膜；放入-80℃冰箱保存。
2) 或者将肠道灌洗液先低速离心（200-500 g 离心5 min）收集上清液，然后将上清液 12,000 g 离心 10 min，弃上清保留沉淀，然后将沉淀管装入自封袋密封，放-80℃冰箱保存。
1.1.5 直肠棉拭子法
1) 不易获得粪便时，可采用直肠拭子法进行肠道微生物样本的采集。
2) 使用肥皂、水和70%的酒精分别清洁肛门周围，然后将无菌拭子用生理盐水湿润后插入肛门 4~5 cm （幼儿 2~3cm） 肛门括约肌处轻柔的旋转，于肛门隐窝处取样（拭子上明显可见粪便痕迹），每个样本提供 3-5 个棉拭子。
3) 然后插入无菌冻存管（或将棉拭子头部剪落入冻存管中），旋紧盖子，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中。
4) 在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。
1.2 口腔样本
口腔样本微生物组学最低起始量（仅供参考）：
1、 口腔样本棉拭子建议 2-3 根以上（扩增子测序 16S/ITS），不推荐宏基因组测序。
注： 口腔类型样本做宏基因组 ， 存在宿主DNA 占比较高的情况。
2、 DNA 样本：浓度≥10 ng/L ，总 量>50 ng，体 积 ≥20 μL，OD260/280=1.8~ 2.0 ，OD260/230= 1.5~2.0，并 确 保 DNA无降解 。
3、 样本保存切记反复冻融。
1.2.1 人体口腔微生物样本
口腔内各部位组成如下 ，主要包含唾液、软组织部分（舌背、上颚、口腔粘膜、角质化
的牙龈、腭扁桃体、咽喉）、坚硬部分（龈下牙菌斑和龈上牙菌斑）。
图 口腔组成示例图
1.2.1.1 口腔唾液
1) 取样前 1 h ，不要进食、饮水、饮酒、吸烟或嚼口香糖，建议晨起取样。
2) 受试者需要至少在口腔中分泌收集唾液 1 min。打开无菌唾液采集器 ，采集未刺激流下的唾液。此过程需要重复多次采集到 2-5 mL 唾液（不含泡沫部分）。马上置入-80 °C 冰箱保存。
1.2.1.2 牙菌斑
1) 取样部位 ：龈上牙菌斑（位于牙龈缘以上的牙面）、龈下牙菌斑（位于龈下 ，为牙龈所覆盖），两者处理方式相同 ，在获得龈下牙菌斑时需注意清楚残留的龈上牙菌斑。
2) 取样前需要记录牙菌斑取自哪颗牙齿 ，如臼齿 ，前臼齿 ，门牙等（取样时注意丢弃出血样本）。
3) 推荐使用环状无菌取样器或者无菌刮匙器 ，刮取尽量多的牙菌斑（无菌棉拭子反复擦拭），直接放入无菌冻存管中低温保存和运输。如果牙菌斑含量较少 ，可以用 PBS 将取样器上的牙菌斑洗下，将 PBS 一并放入无菌冻存管中（ PBS 的量不能超过 6 ml），置入-80 ℃冰箱保存。
图 牙菌斑取样位置
1.2.1.3 舌背菌斑
1. 采样前准备 ：取样前请受检者清水漱口，去除口中可能含有的食物残渣；
2. 采样用无菌棉拭子（无菌生理盐水润湿），以增加微生物附着率。将无菌拭子伸进口腔 ，使拭子头部充分接触舌背 ，用适当的力度上下擦动 ，同时旋转拭子，让拭子头部充分接触舌背表明。采集 2-3 根拭子。
3. 口腔拭子插入同一个无菌冻存管（或将棉拭子头部剪落入冻存管中），旋紧盖子 ，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中 ，在最短时间（最长不超过4h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。
1.2.1.4 其他黏膜表面菌斑（颊黏膜、上颚等）
1) 采样前准备 ：取样前请受检者清水漱口，去除口中可能含有的食物残渣；
2) 用无菌棉拭子（生理盐水湿润）擦取颊黏膜、上颚等部位表面的微生物 ，充分擦拭后将其放入无菌冻存管中，采集 2-3 根拭子，旋紧盖子 ，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。
图 口腔黏膜表面菌斑的取样过程
注意事项：
①舌背：要求受试者在采样前用无菌水漱口 3 次（每次 10 mL）以去除食物残渣，使用无菌棉拭子从舌背中部擦拭 3 次（每根棉拭子/大约 2 cm长的擦拭动作）。
②上颚 ：无菌棉拭子擦取整个坚硬的上颚，约 10 s。
③口腔粘膜 ：无菌棉拭子擦取左侧和右侧的整个口腔粘膜区，每侧约 10 s ，要注意不要接触到牙齿。
④角质化的牙龈 ：无菌棉拭子擦取颚前方的牙龈，约 10 s。
⑤腭扁桃体 ：无菌棉拭子分别擦取左侧和右侧的腭扁桃体 5 s。
⑥咽喉：由于条件反射 ，这个部位非常难收集 ，若需要取 ，建议取完别的部位后再取 ，慢慢地将拭子放入咽部后方 ，约 5 s 注意不要刮到扁桃体。
1.2.2 其他动物口腔微生物样本
1.2.2.1 小鼠口腔拭子样本采集：
1) 用 75％乙醇清洁工作表面、机架、剪刀，紫外灭菌 30 min。
2) 抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢 ，先用沾有 75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发。
3) 准备好无菌棉拭子 ，在鼠的口腔内部表面擦拭，从舌头、峡部、上牙龈、上颚以及下牙龈和唇部 ，约 30s；采集 2-3 根棉拭子。
4) 采样结束后快速剪切头部落入无菌冻存管中 ，扣盖后立即将管放在-80 ℃保存。
1.2.2.2 小鼠口腔唾液样本采集
1) 将小鼠麻醉固定后 ，用止血钳夹持舌尖，将舌尖牵出略偏向一侧。
2) 用准备好的无菌棉球放入小鼠下切后方舌下区域放置 30 min 以上。
3) 如有条件建议在小鼠皮下推注毛果芸香碱 （ 2 mg/kg） 增加唾液分泌量。
4) 收集到的唾液放入-80 ℃保存或运输。
1.2.2.3 家畜类动物唾液样本采集（猪、狗、羊、兔和马等）
1) 可直接采用棉球收集法 ，将棉球通过钳子放入动物口中 ，引导其咀嚼。
2) 收集棉球通过离心将棉球中的唾液分离出来 ，去除杂质。
3) 收集唾液 1-2 mL 以上，并置于-80 ℃保存。
1.3 皮肤样本
1) 取样前24 h 不能洗澡，不能使用润肤乳及抗菌活性的肥皂等；取样前 7 d 不能使用抗菌成分的沐浴用品。
2) 将生理盐水浸湿的无菌棉拭子按在取样表面上，用力使其弯曲与擦拭表面成 45 度，平稳而缓慢地擦拭取样表面（取样区域为 4cm2）。翻转棉拭子，让拭子的另一面也进行擦拭，但与前次擦拭移动方向垂直，采集 5~6 根拭子。
3) 擦拭完成后，将每个取样点的拭子集中插入同一个无菌冻存管（或将拭子头部剪落入冻存管中），旋紧盖子，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。
1.4 乳汁样本
1) 低速离心，200g，5-10min，避开上层脂肪层，吸取下层液体。
2) 根据需要过 0.22μm 可拆卸的滤膜或高速离心收集菌 体（也可≥8000 g 离心 10min 收集沉淀，但是不推荐，具体情况请根据实验室条件决定）。
3) 富集的菌体管马上放入装有碎冰 或冰袋的保温盒中，尽快（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。
1.5 尿液样本
1) 采集尿液之前用中性肥皂水或者清水对尿道口周围进行清洁。
2) 采集受试者晨尿的中段尿液 50 mL 左右（中段尿：在排尿过程中，弃去前、后时段排出的尿液，以无菌容器收集中间 时段的尿液；或在开始排尿 3 S 后采集尿液，当尿液量达到 50 mL，即认为完成收集）。
3) 将尿液样本马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 1 h）送至实验室进行菌体富集。尿液在 4 ℃， 10,000 g 离心 5 min 富集菌体。将沉淀立即置于-80 ℃保存。
1.6 生殖道样本
1) 48h 内无性行为，不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为，30d 内不能用抗生素和抗真菌类药物。
2) 将采样拭子伸入需要取样部位，轻轻旋转 3-5 圈，慢慢取出。采集 2~3 根拭子。
3) 将拭子插入无菌冻存管（或将拭子头部剪落入冻存管中）， 旋紧盖子，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80℃保存。
1.7 呼吸道样本（肺泡灌洗液等）
4) 呼吸道由鼻腔、鼻咽、口咽、气管和肺构成。呼吸道呼吸到的空气颗粒物，粒径大于10μm 沉积在上呼吸道，
5) 粒径小于1 μm 的颗粒会沉积在肺部，其中粒径大于 0.4 μm 的颗粒会包含微生物和病毒。呼吸道中鼻腔和鼻咽部分的微生物含量大约为 1000 菌体/拭子，口咽微生物含量最高，能够达到106 菌体/mL 口腔漱液，肺泡灌洗液微生物含量最少，大约在100 菌体/mL 肺泡灌洗液（Nat Rev Microbiol. 2017; 15(5): 259-270.）。
呼吸道微生物取样方法
呼吸道生理学参数和微生物数量梯度
The microbiota of the respiratory tract: gatekeeper to respiratory health - PubMed2017 May;15(5):259-270. doi: 10.1038/nrmicro.2017.14. Epub 2017 Mar 20.
呼吸道由鼻腔、鼻咽、口咽、气管和肺构成 ，如上图所示 ，呼吸道呼吸到的空气颗粒物 ，粒径大于 10um 沉积在上呼吸道 ，粒径小于 1um 的颗粒会沉积在肺部 ，其中粒径大于 0.4μm 的颗粒会包含微生物和病毒。 呼吸道中鼻腔和鼻咽部分的微生物含量大约为 1000 菌体物/拭子 ，口咽微生物含量最高 ，能够达到 106 菌 体/mL口腔漱液 ，肺泡灌洗液微生物含量最少 ，大约在100 菌体/mL肺泡灌洗液。
1.7.1样本来源信息采集
1、 详细调查最近的口腔感染、炎症、脓疱、溃疡、 良性或者恶性包块等口腔病史 ，并采集相应信息 ；
2、 因为抗生素对人体菌群影响较大 ，取样前 3 个月内没有使用过抗生素 ；若有 ，请注明使用时间及种类。
1.7.2采集方法
1.7.2.1 口/鼻咽拭子样本采集
1) 受试者采样前 1h 内禁止进食和饮水。
2) 口咽部样本采集选择头口连接处到扁桃体柱头间的区域 。
3) 左右鼻咽样本采集方式为拭子穿过鼻孔后擦拭。
4) 口咽部麻醉后用灭菌棉拭子在受试者口/鼻咽采集部位旋转 1 周 ，在取样时避免触及舌、 口颊黏膜和唾液、鼻腔等非采集部位。
5) 取样后将棉拭子头（ 2-3 个）剪下放入灭菌冻存管 ，液氮速冻 ，-80℃保存 ，干冰寄送。
1.7.2.2 气管样本采集
1) 样本采集前支气管镜使用生理盐水冲洗支气管镜管道（ pre-wash ）。
2) 受试者使用生理盐水漱口 90s 。
3) 口咽喷雾麻醉后前端带有无菌棉签的支气管镜经口插入直达声门处取样（ 已经实施局部麻醉 ，并可见呼吸道分泌物 ），。
4) 支气管镜取样后将棉拭子头（ 2-3个 ）剪下放入灭菌冻存管 ，同时生理盐水冲洗支气管镜管道（post-wash）。
5) 棉拭子头和生理盐水冲洗液为采集到的样本 ，液氮速冻 ，-80℃保存 ，干冰寄送。
1.7.2.3 肺泡灌洗液（BAL）
支气管肺泡灌洗技术 ：以纤维支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平 ，反复以无菌生理盐水灌洗、 回收的一项技术。
1) 采集前准备：无菌生理盐水冲洗所使用器材支气管镜按照手术需求进行局部麻醉。
2) 采集：经操作孔道注入适量无菌生理盐水（总量一般60-120mL，分次注入）负压吸引收集灌洗液，测微生物菌群建议体积量为50mL左右，尽量多，收集至无菌离心管/容器中。
3) 样本处理：为去除部分组织碎片，可采取无菌滤膜（孔径：10微米左右）过滤，微生物样本收集，可通过继续过滤（孔径0.22μm/更小滤膜），获取的滤膜需要放入冻存管中液氮速冻（若体积过大，可用无菌简单剪碎后放置）；也可使用离心法富集，1500-1800g，离心15-20min，取沉淀，液氮速冻。
4) 寄送保存：液氮速冻样本后干冰运输，样本保存于-80℃冰箱。
5) 影响因素：
宿主基因组的影响
无菌灌洗液灌洗中不仅会洗脱微生物 ，还会将上皮细胞等宿主细胞洗脱下来 ，若和微生物混
在一起抽提得到的DNA会含有大量的宿主DNA ，因此最终的宏基因组数据中会含有大量的宿主基因组 ，高的可能高达99%。
（案例 ：人粪便宏基因组项目宿主基因组比例一般在 10%-30% ，火腿的宏基因组宿主基因组有高达 90%-99%等）
解决方法建议 ：取样时尽量去除宿主细胞 ，保留微生物。
1) 尽量去除宿主细胞 ：灌洗回收液先用 10μm 左右（ 9-11μm ）的过滤膜过滤去掉部分完整的上皮细胞 （一些细胞碎片直径会变小 ，不能被完全除掉 ，但可以去除部分）。
2) 保留住微生物 ：过滤宿主细胞后的过滤液用 0.22um 的过滤膜（无菌操作 ，采用可拆卸的过滤膜 ，可自由从过滤器中取出 ）截留细菌 ，过滤膜用于 DNA 提取（需放入冻存管中 ，液氮速冻 ，可以用无菌剪 刀剪碎过滤膜放入冻存管中速冻 1h ）然后负 80 度低温冰箱保存 ，收集一定数量的病人肺部微生物过 滤膜后统一干冰运输寄送。
3) 如果老师除了关注细菌 ，还关注病毒 ，建议用 0.22μm 的过滤膜截留细菌后的过滤液继续用孔径更小 的过滤膜过滤（建议小于 20nm ）或者水样病毒沉淀剂让病毒沉淀下来 ，离心收集病毒沉淀物 ，放于 冻存管速冻 ，低温保存。
微生物量的影响
不同的病人肺部微生物含量不一 ，可能有些病人灌洗下来的微生物量非常少 ，提取获得的DNA 量也会 很少 ，当 DNA 量少于 1μg时可以采用微量建库 ，但 DNA 量越小建库失败几率越高 ，因此建议获得足够的 DNA 量。 因此前期采样建议用大量的灌洗灌洗 ，洗脱足够多的微生物。
解决方法建议 ：客户可根据自身实际情况去修改方法 ，建议客户先采样做预实验 ，通过预实验样品的 数据情况检测客户的采样流程。如果没问题再建议大量取样 ，送样。
另外最开始测序建议客户提高测序数据量。
1.8 胎盘
1) 根据标准的产科实践，将受试者胎盘分娩后，清楚胎盘表面母体蜕膜和胎儿的绒毛膜/羊膜并丢弃（避免在递送期间或 者样本运输期间发生相关污染），立即放置无菌干净容器中，转置无菌实验室（若胎盘分娩在手术室内，也可在手术室 内洁净区域进行取样）。
2) 从胎盘的不同区域周向切除6 个 1cm×1cm×1cm 的立方形切片，每个区域距离脐带插入部位 4cm。
3) 取样至耐-192℃低温的冻存管或进口 EP 管（用封口膜牢牢封住），液氮速冻为可选项，-80℃保存，干冰寄送。
注意事项：胎盘样本切片由病理实验丰富人员带着面罩和无菌手套，采用无菌手术刀和器械进行切除。另外从胎盘分娩到样 品取完最好控制在 1h 以内。
1.9 痰液（必须由客户自行提取好 DNA后寄送）
自然咳痰法：患者晨起后，用温开水或无菌生理盐水漱口 3 次，以减少常居菌的污染，然后用力咳出深部痰液于无菌痰杯中， 密封后送检。采集痰量不能少于 2mL。勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。
诱导咳痰法：对咳痰困难者，先用湿牙刷清洁口腔粘膜、牙龈和舌，无菌水或生理盐水漱口，然后用雾化吸入 20-30mL3%NaCl， 最后用无菌容器收集诱导痰液样本。
气管镜采集法：用支气管镜在肺内病灶附近用导管吸引或用支气管刷直接取得痰液样本。 小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将棉拭子伸入咽部，小儿受到刺激喷出肺部或气管分泌物粘贴在拭子上。
注意事项：
a.以晨痰为好，多数病人清晨痰较多，易于采集。
b.最好在抗菌药物之前或者抗菌药物停药一周后。
c.样本采集后，液氮速冻，置于-80℃冰箱内低温。
d.实验室不接收痰液样本，请提取好 DNA 再送样。推荐试剂盒品牌包括 Omega 和 Qiagen 专用病原微生物 DNA 提取试剂盒。
2.动物的微生物实验样本采集
2.1 大中型动物粪便样本的采集
1) 在清晨集中采食时或采食后不久的一段时间后，收集新鲜的粪便样本。
2) 用无菌的粪便取样器（如无菌棉签）进行粪便样本的取样。因粪便表层含有肠粘膜脱落细胞，而外部容易污染，且接触 空气后，部分细菌 DNA 开始降解，所以取样时要截取中段内部的粪便样本（200~500 mg），并立即置于无菌的 2 mL 冻存 管中，用封口膜封口，每个样本取 3-5 管备份。
3) 注意事项：
尽量避免粘连沙土和碎石，同时尽可能不要取较稀或尿液过多的部分。样本采集分装好后，马上放入装有碎冰或冰袋的 保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行DNA 抽提或-80 ℃保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融， 以免影响后续实验结果。
2.2 小型动物（如小鼠）颗粒粪便样本采集
1) 实验动物饲养在独立通风笼中，取样前在笼子里铺上消毒滤纸。
2) 在指定时间内收集小动物的新鲜粪便（小鼠 ≥ 5 粒，大鼠 ≥ 3 粒，约 100~200 mg），装入无菌的 2 mL 冻存管中，并用封口膜封口。应留取备份样本。
3) 样本采集分装好后，立即置入-80 ℃冰箱保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融，以免影响后续实验结果。
辅助材料——16s/宏基因组动物粪便收集方法
1) 超净工作台灭菌 15 分钟，通风 5 分钟，酒精擦拭工作台桌面（实在没有超净工作台就尽可能找洁净的场所，尽量避免 外源菌污染）。
2) 在无菌冻存管管盖和管壁上都写上样品名称，注意，样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合， 而且字符数不小于 3 且不大于 9。
3) 腹部按摩法促使动物（以大鼠为例）在超净工作台排便，至少两粒到三粒粪便，有条件要做好备份，其中一份送给公司，另一份自己保存在-80℃冰箱备用。
4) 如果是小鼠，粪便粒数加倍，其他动物粪便量参考大鼠即可。
5) 根据分组等情况，将冻存管保存在自封袋中，自封袋缓存在冰上，以避免菌群生长。
6) 酒精擦拭工作台桌面，继续取样。 样品采集后 2 小时内保存到-80℃冰箱。注意，有条件的话冻存管采集完粪便样本后可以液氮速冻 1h。
2.3 肠道内容物
1) 待实验对象死亡后，在无菌操作台或灭菌环境下用无菌解剖刀取出整个肠道，切取所需肠段。
2) 用无菌手术刀挖取内容物，装入无菌 2 mL 冻存管中（100-200 mg/管），每个样本取 3-5 管备份。
收集样本时，若 肠道粘膜或者粘液含量较多会影响提取和扩增，所以样本收集时一定要将内容物刮出置于收集管中。若只剪开肠道，久置肠道粘膜或粘液会与肠道内容物浸泡在一块，后期取样不好分离，影响实验结果。
3) 对于肠道极小的动物，如无法用解剖刀剪等工具挖取内容物，可采用无菌注射器或移液器吸取少量无菌生理盐水，将注射器针头或移液器吸头插入肠道中，将内容物冲出的方式收集样本。若冲洗后的液体较多可通过离心富集沉淀。
4) 样本采集分装好后，立即置入-80 ℃冰箱保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融，以免影响后续实验结果。
2.4肠道组织
方法1：肠道样本用无菌 PBS 缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出，用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织细菌进行 DNA 的提取。
方法2：取相应肠段样本，在无菌操作台上用灭菌解剖刀或剪刀切取指甲盖大小（1cm2 左右）的组织
块，放入离心管中，上述操作完成后，迅速放入液氮中 1 h 以上，然后置入-80°C 保存。
2.5 瘤胃样本
1) 采集前，试验动物须进行 15 天以上的预饲，采集时间根据具体研究内容而定，避免在刚采食饮水后进行。
2) 通过瘤胃瘘管法、口或鼻插入胃管法、穿刺法，收取瘤胃液内容物（10-15 mL），通过四层无菌纱布过滤，滤液采用 12,000g 离心 10 min，收集沉淀。由于该类样本很容易降解，因此需立刻置于-80℃或者液氮保存便于后续DNA的提取。
3.植物的微生物实验样本采集
3.1植物内生菌
1) 根据研究选取新鲜植物组织（2~5 g），用无菌水清洗除去植物样本表面的杂物。
2) 再依次用70%无水乙醇和2.5%次氯酸钠，浸泡 40 s 和 10 min，每 100 mL 2.5%次氯酸钠加一滴吐温80。
3) 无菌水清洗2-3 次，至消毒液彻底去除，最后用灭菌滤纸将水分吸干。将组织置于液氮速冻 1 h 以上，转至-80 ℃保存。
4) 如条件允许，可取最后一次漂洗液涂布于平板以检测表面消毒是否彻底。
3.2根表面菌
1) 将所研究的样本放在无菌容器当中，加入PBS 缓冲液（完全淹没样本）后进行振荡。
2) 使得微生物从根表面充分的脱落 并聚集在 PBS 缓冲液当中，震荡至少 2 h 以上。
3) 将缓冲液用 0.22 μm 滤膜过滤，将滤膜装入合适的冻存管液氮速冻 1 h 以 上，转至-80 ℃保存。
3.3叶外生菌
1) 用灭菌剪刀裁剪得到等重量的叶片，置于装有 PBS 缓冲液的无菌离心管中静置一段时间，离心去上清液，加1 mL 缓冲液重悬，液氮速冻，置于-80℃保存。
2) 若样本量大，可用无菌医用棉签 2 至3 根经缓冲液湿润后在叶表面擦拭，后在装有磷酸盐缓冲液的离心管中搅动，离心去上清，再用 1 mL 缓冲液重悬，液氮速冻1 h 以上，转至-80 ℃保存。
3.4茎外生菌
对植物茎片段使用无菌水振荡（或超声波）洗涤多次，收集洗涤液以 0.22 μm 滤膜过滤，将滤膜装入合适的冻存管液 氮速冻 1 h 以上，转至-80 ℃保存。
4.土壤的微生物实验样本采集
4.1土壤采样前期准备之器具准备
为了采样顺利开展，请提前准备好以下采样器具以及其他所需材料。采样工具和盛放土壤样本的容器必须提前灭菌（锡 箔纸包裹，高压蒸汽灭菌后，120 ℃烘箱过夜），避免外源物质干扰。
4.2采样位置选择
根据研究目的，进行采样点的选择，采样点的选择应遵循以下原则：
A. 采样点土壤类型特征明确，地形相对平坦、稳定，植被良好。
B. 坡脚、洼地等具有从属景观特征的地点不宜设置采样点。
C. 城镇、住宅、围墙、道路、沟渠、田埂、粪坑、堆肥点、坟墓等地人为干扰大，可能造成土壤特性错乱，使土壤失去代 表性，不易设置采样点。
D. 采样点离铁路、公路至少 300 m 以上。
E. 采样点以剖面发育完整、层次较清楚、无侵入体为准，不在水土流失严重或者表土被破坏处设采样点。
F. 不在多种土类、多种母质交错分布、面积较小的边缘地区布设采样点。
注意事项：确定采样点后可以使用精准地图或者GPS 进行采样点定位，或者在采样点进行标记，便于以后重复取样或者进行比较试验。
4.3取样方法设置
注意！同一次实验，同一种方法。
A．土壤横向取样方法示意图：
B．土壤纵向取样方法示意图：
4.4 普通土壤
1) 去除土壤上面的覆盖物，包括植物、苔藓、可见根系、凋落物以及可见的土壤动物等。
2) 对采样器使用酒精棉擦拭，待酒精挥发完全后，可使用采样样方处土壤浸润采样器。后续每次更换样方均需重复此步骤。
3) 同一样方多点混合取样（建议 3-5 个点等量混合），去除样本中的植物、可见动物以及石粒等，然后根据土壤情况，选 择是否过筛，
1、 推荐过 2 mm 筛；
2、 一些有机质（如粗腐殖质或泥炭等）不能通过 2 mm 筛，此时可以选择过 4-5 mm 筛；
3、 如果土壤粘度太大或者含水量太高，可以选择不过筛。
4) 将混合好的土壤样本，分装多份，每份3-5 g，液氮速冻（如果条件不允许，可以选择放在冰盒中，尽快运回实验室）， 随后转移至-80 ℃冰箱保存，用于测定土壤微生物；另外留出一部分土壤，用于测定土壤理化指标（如有机质、全氮、 矿质元素等）。
4.5 根际土壤
4.5.1作物类（草地等矮小植物）根际土壤
1) 采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室。
2) 晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤。
3) 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻 1 h 以上，置于-80 ℃冰箱保存。
4.5.2林木类根际土壤
1) 采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室。
2) 过2-5 mm 孔径无菌筛网。
3) 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻 1 h 以上，置于-80 ℃冰箱保存。
4.6活性污泥/沉积物类
同一活性污泥装置，进行多点取样并等量均匀混合至约 10 mL 的悬浮污泥样本或5-10 g 沉降物，保存无菌冻存管，液 氮速冻或冰/干冰避光运回实验室，置于-80 ℃保存。若液态污泥样本沉降物较少，需加大取样量。
4.7水体/地表沉积物
主要包括城市、河流、管道污泥，海底、江河、湖泊、冰川等环境沉积物。使用重力取样器取距离
水底/地表 0-10 cm（具体按实验目的而定）沉积物（底泥）5-10 g，保存无菌冻存管中，液氮速冻或冰/干冰避光运回实验室，置于-80 ℃保存。
4.8岩石、砂砾类岩石
1) 取 10 根经无菌水湿润的消毒棉签，擦拭岩石表面，面积约35cm2，保留拭子放入无菌离心管（可事先装入 6 mL无菌水），置于冰上运送至实验室。
2) 将样本超声 20s，接着涡旋 1 min，再超声 20 s，无菌移除拭子，18000 ×g 离心 10 min，去上清，收集沉淀，进行 DNA 提取。拭子数量和擦拭面积可依实际情况酌情增减。
注意事项：采集其他体积较大的样本表面微生物均可参考此方法。
4.9沙石
1) 无菌采集沙石样本保存无菌袋或冻存管中，置于冰上运送至实验室。
2) 使用 50 mL 无菌水浸没沙石，大力晃动数秒（或低速离心孵育一定时间），收集液体，使用0.22 μm 孔径滤膜过滤，将 滤膜样本置于无菌冻存管中，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。
3) 注意事项：采集颗粒类样本表面微生物均可参考方法。
5.水体的微生物实验样本采集
5.1水体采样器具准备
为了采样顺利开展，请提前准备好以下采样器具以及其他所需材料。采样工具和盛放水体样本的容器必须提前灭菌（如 锡箔纸包裹，高压蒸汽灭菌后，120 ℃烘箱过夜），避免外源物质干扰。
a)普通采样器：在进行河、湖或者是海洋等表层水体采样时，可以使用处理后的塑料瓶即可。
b)排空式采样器：一种手动简便易行的采样器，该采样器可以沉入预定的深度进行特定深度水体样本的采集 。
c)多通道综合深度采样器：此类设备可以用于深海水体样本的采集，保证水体样本微生物群落结构的稳定。
5.2采样容器洗涤
1) 容器洗涤：将容器用水和洗涤剂清洗除灰尘、油污后，用自来水冲洗干净，再用 10%的硝酸或盐酸浸泡8h，取出后用自来水冲洗 3 次，最后用蒸馏水充分淋洗干净。
2) 容器灭菌：高温高压灭菌，并及时烘干容器；如果无法灭菌，可以使用 75%酒精和无菌水反复冲洗。
注意事项：处理后的容器应在 2周内使用；更换样地进行样本采集前，使用酒精对仪器设备进行消毒灭菌处理，或者使用样 地水体对仪器设备进行润洗。
5.3水体取样方案
1) 样本采集：水体的取样深度和范围可以根据实验目的进行确定选择，并采用相应的采样器进行样本采集。
2) 样本处理：根据实验设置，选取适当孔径的滤膜（常用0.22μm孔径），使用水体抽滤机抽滤 1~100 L 水体（不同水质间差异极大，根据水质选择抽滤体积），或抽滤 至滤膜上可见明显覆盖物。收集滤膜进行 DNA 提取或置于-80 ℃冰箱保存。
注意事项：根据水体中微生物含量，依据项目经验，污水等菌群丰富的水体用量一般为200-1000 mL，湖泊、河流等自然水体一般为 1-2 L，自来水等菌群含量较低的水体则一般为 1-5 L，甚至更多。如果体积超过 2mL，且细菌含量较低，需要全部上样提取，则不可直接冻存后送公司，因为冻融过程中液体里的细菌极可能破裂，到公司后通过离心或者过膜收集菌体时已 经无法收集到已经破裂的菌体。正确的处理方法是在样品冻融前进行离心或过膜处理，将滤膜或者离心得到的沉淀送到公司。
5.4滤膜选择
滤膜孔径大小选择（不同材料有不同的界定，下述数据仅供参考）
Ø 0.22 μm 适用于细菌/病毒。
Ø 0.8 to 5 μm 适用于超 微浮 游 生物 （ Piconanoplankton）。
Ø 5 to 20 μm 适用于微型浮游生物（Nanoplankton）。
Ø 20 to 180 μm 适用于小型浮游生物（Microplankton）。
Ø 180 to 2000 μm 适用于中型浮游生物（Mesoplankton）。
5.5抽滤操作
通常情况下，对环境水体微生物进行检测之前，需要通过抽滤装置对水体样本中的微生物进行富集，具体抽滤装置如上 图。抽滤时，先将真空泵打开，然后将环境水体倒入，当滤膜表面有可见覆盖物后，可以停止加样。抽滤结束后，先拔掉抽 滤管，再关闭抽滤泵，防止倒吸。用镊子将滤膜取出，放入冻存管中，保存于-80 ℃冰箱，尽量使用 1 张滤膜进行样本富集。
5.6离心处理
1) 通常情况下，环境水体样本的富集推荐使用真空抽滤的方法，如果样本浑浊度很大或者没有抽滤装置，可以考虑使用离 心的方法进行富集。此方法只作为备选方法，不推荐使用。
2) 水体样本浑浊度较大的情况下，可以使用小型离心管，离心 2-6 mL 样本后送沉淀物（管底要有一定量的沉淀物），13000 g 离心 5-10 min。
3) 水体比较澄清的情况下，需要加大离心的样本量，这时可以使用大离心管，离心50-100 mL 甚至更多体积的样本，送 样标准依然是以底部有一定量的可见沉淀物为准。通常大型离心机的转速不是很高，可以适当的增加离心的时间。
6.发酵液
1) 对于水质较为混浊的（微生物含量较为丰富的发酵液）水体，三点取样混合摇匀。
2) 取8-10mL 分装至两个耐-192℃超低温的无菌 5mL 离心管中，每个分装 4mL（注意不要分装过满，防止水样冻存体积膨胀致使离心管破裂，被其他微生物污染）。
3) 液氮速冻，-80℃保存。
7. 气体的微生物实验样本采集
1) 对于空气样本采集，建议使用专门的空气收集仪器，使用时注意对专用采样仪器的进样头、切割头和膜托等关键部位进行清洗。
2) 空气收集仪器的采样模式大概分为两种，一种是无菌滤膜收集方法，另一种是液体撞击式收集方法：
无菌滤膜收集方法：可将无菌滤膜置于采样器中（滤膜材质为玻璃纤维，直径 80 mm），空气流量为 1 L/min，收集1-2h。
液体撞击收集方法：建议用无菌水或者PBS 缓冲液作为样本吸附液，收集完后，对含有空气微生物的吸附液进行 离心或者过滤浓缩的方法提取DNA即可。
3) 对于无菌滤膜收集方法，可以通过寄送滤膜的形式将收集的空气微生物样本运往公司，运输途中建议干冰寄送，干冰需要5-10 kg；
4) 对于液体撞击收集方法，将吸附液过滤后的滤膜寄送，过滤的步骤可以参照灌溉水样的样本采集流程；样本运输建议干冰寄送，干冰需要 5-10 kg。
8. 辅助材料
8.1 致病细菌灭活和收集（用于 DNA 项目）
1) 菌液体培养物混匀，取3ml 入 15ml 离心管，加入 7ml 无水乙醇混匀（至乙醇终浓度为 70%）室温处理 2 小时。
2) 4500g 离心 10min，沉淀菌体，弃上清。
3) 加入1-1.5ml 无菌 PBS 或生理盐水重悬，转移至 1.5ml 离心管，8000g 离心，10min，弃上清。
4) 再加入1ml 无菌 PBS 或生理盐水重悬，再次 8000g 离心，10min，弃上清。
5) 沉淀可进行DNA 提取实验，或冷冻保存。
注意：上述体积可根据实际情况调整，需要注意的是，不论体积如何，加入乙醇使终浓度 70%-75%，加入的菌 PBS 或生理 盐水的作用是去除残余的乙醇，可增大体积或增加洗涤次数。
8.2 致病菌灭活和收集（用于 RNA 项目）
细菌真菌 RNA 提取有独特的方法，如客户需要，实验室可以通过销售或项目管理申请，向客户提 供两种试剂（溶液 A，溶液 B），对致病菌样品进行预处理。该步骤仅适用于做 RNA 项目的样品。
处理流程主要包括：
8000g 离心 10min 收集菌体（约 10-50mg，不超过半颗黄豆大小，如超过，则需要增加加入溶 液量）。
加入500μL 溶液 A 重悬。
加入 500μL 溶液 B，剧烈震荡混匀，（AB 不互溶需要剧烈震荡为乳浊液，防止分层）。
-80℃ 保存，干冰运输。
8.3 土壤 RNA 样品预处理
8.3.1一般土壤
不同地域土壤，极低海拔或高海拔地区；不同处理土壤，如追肥、足灌、耕作方式、污染程度等；根系及非根系土壤，研究根际及非根际，根表及根内微生物等。
取样方法
（1）采样所用工具或其他物品都要事先灭菌，或用采取的土壤擦拭。
（2）取5-10 cm处普通土壤，针对际土壤，需采集20 cm深的土壤于50mL的无菌管里，多点采取重量相当的土壤进行混匀，去除杂质后再取一定量土壤装入无菌管，每个样品取样2-10g，迅速放在液氮里冻存。
（3）密封后用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
注意事项：为防止交叉污染，不建议使用自封袋取样。
8.3.2 污泥样本
不同类型污泥，如水池、沼气池、生物电池等；不同处理污泥，如地域、深度、污染程度等。
取样方法
（1）活性污泥样本取自活性污泥装置中，一般取样量大于20ml，将其置于无菌管中，建议立即提取后-80℃保存。
（2）海洋沉积样本根据研究目的进行取样，一般建议取50g 以上的沉积物装入冻存管中，低温运输并尽快进行提取-80℃保存。
注意事项：活性污泥样本等一般建议及时提取，样本体积较大，长时间-80℃保存，主要是冻融提取比较困难，加大了实验工作量及难度。建议提取后保存RNA即可。
针对固体样品可以直接冻存送样。建议使用RNA保护剂保存，具体方法如下：
（1）每克土壤加入2~2.5倍体积保护液，如1g土壤中加入2~2.5 ml保护液。注意：若对象是底泥沉积物样品，每克湿重样品请加3倍体积保护液。
（2）涡旋或手工摇匀，使样品与溶液混匀，保护液液面应当高于土样层。根据情况-20℃、4℃或室温保存。
（3）提取样本RNA时，2500×g离心5min，移除Tube管中的保护液，收集土样。
备注：常用保护液为LifeGuardTM Soil Preservation Solution或RNAprotect Bacteria Reagent。
8.3.3 水体样本
不同类型，如海水、污水、养殖水等水体；
不同处理，如处理时间、深度、受污染程度等水体。
取样方法
（1）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45 μm的滤膜，取样体积大于5L。
（2）对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤。
（3）将滤膜冻干后，用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。