10x Xenium 原位分析样品包埋及运输指南
一、Xenium 原位分析技术
（适用于人和小鼠新鲜及 FFPE 样本）
1 Xenium 原位分析技术适用的样本类型（任意一种样本即可）
10x Xenium 原位分析技术采用探针法进行基因的杂交和表达检测， 目前仅适用人、小鼠物种的组织样本。其中可根据具体的组织样本选择 panel list ，也可以定制化 panel list 。 目前已有的 panel list 包括:
①小 panel：
人乳腺（280 基因）；人脑（266 基因）；人肺（289 基因）；人皮肤（282 基因）；人肠道（325 基因）；人肿瘤免疫（380）；人泛组织（癌）（377 基因）；小鼠脑（247 基因）；小鼠泛组织（379 基因）。
②大 panel：
5000（人）；5000（小鼠）
探针链接：
https://www.10xgenomics.com/support/in-situ-gene-expression/documentation/ steps/panel-design/pre-designed-xenium-gene-expression-panels
由于定制 panel list 需要一定的周期， 因此如需要定制化服务请提前与项 目经理/技术支持联系， 以确认定制化周期以及需要满足的定制化要求。
1.1 石蜡包埋的样本
石蜡块具有一定的厚度，建议厚度 2-5mm。石蜡块封装好常温或 2-8℃寄送至联川生物实验室 。 由于实验流程限制，不能接受石蜡白片，只允许寄送石蜡块。
1.2 OCT 包埋的样本
提供新鲜组织的 OCT 包埋块，组织离体之后，擦干组织，做 OCT 冰冻包埋，封装好干冰寄送至联川生物实验室。
2 质检标准
目前 Xenium 没有明确的质检标准，仅以 RNA 质检完整性与组织形态作为参考指标。
2.1 FFPE 样本
形态质检（重要）：
HE 染色：确保组织形态完整，无断裂
RNA 质检（参考）：
(1) DV200≥30%：质检合格
(2) DV200<30%：不合格，不建议进行下游实验
2.2 OCT 包埋的样本
形态质检（重要）：
HE 染色：确保组织形态完整，无断裂
RNA 质检（参考）：
RIN≥4.0
Tips：Xenium 关注的重点是组织形态，故对做 Xenium 的样本中重要的质检是组织形态及HE 染色，确保组织形态完整无断裂。
3 Xenium 石蜡样本原位分析样本制备流程
3.1 所需试剂和耗材
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名称 |
厂商 |
货号 |
备注 |
提供方 |
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福尔马林/固定液 |
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客户自备 |
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组织包埋盒 |
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客户自备 |
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医用手术刀 |
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客户自备 |
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医用镊子 |
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客户自备 |
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吸水纸 |
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客户自备 |
3.2 石蜡样本的制备过程
3.2.1 取材
根据 10x Xenium 原位分析区域大小需求（芯片大小为：12x24mm ，实际可贴片的区域为：10.45x22.45mm）进行准备，允许稍大于芯片捕获区域，高度需≥5 mm。如单个组织样本量不足，可将两个组织分别固定、脱水、透明、浸蜡后，石蜡包埋在同一个包埋块内。
3.2.2 组织固定
将材料固定在 10%的福尔马林溶液当中，福尔马林溶液与材料的比例至少应为 10:1 ，推荐使用中性福尔马林缓冲液， 固定时间建议 24-48h ，最好不超过 72h。
1 新鲜组织离体后用实验专用吸水纸擦干表面，立即进行固定，组织缺血离体时间控制在 1h 内。
2 组织尽量小而薄，便于固定剂迅速渗入组织内部，一般厚度不超过 5mm。
3 将组织固定在 10% 的中性甲醛缓冲液中（NBF, neutral-buffered formalin）。固定剂应该有足够的量，一般为组织块体积的 10-15 倍，固定剂需重新配制，不可使用经过长期保存的固定剂。
4 在室温下固定 12-24 小时，（厚度小于 0.5 cm 的组织，对于较大组织可能需要更长的固定时间，具体时间需测试）。
5 提醒：固定时间根据组织类型，组织块大小确定。
6 如固定时间较长，为终止固定，可用水洗去渗入组织中的固定液。
说明：
1 固定不足可能导致组织中出现伪影，例如不规则染色质图案、细胞质过度染色（伊红）和常见的自溶表现，组织中的 RNA 可能因未及时被固定而进-步发生降解。
2 固定过度的组织块可能过硬，切片难度增加，组织 H&E 染色结果可能出现伪影，例如形状不规则或较小的细胞或深染的细胞核。过度固定也会导致某些分子特征的结构完整性丧失、脂质氧化、过度交联，不利于后续探针结合 RNA。
3.2.3 脱水
固定后的组织中因含有比较多的水分，所以需使用不同浓度梯度（70％，80% , 90％，2*95％和 2*无水酒精的脱水程序）的乙醇对组织进行脱水，以确保组织中的水分完全去除干净，为后续的透明及浸蜡做好准备，以保证与透明剂或者石蜡相融合。
1 脱水时间应根据组织块的大小和组织类型而定。
2 组织块在高浓度（无水乙醇）中放置时间不宜过长，无水乙醇吸水能力太强，易造成组织过度硬化，后续切片容易脆裂，同时可能影响 RNA 完整性，进而影响表达检测 UMI。
3 每次更换新的脱水剂时，都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器需晾干水分，以免将水从低浓度脱水剂带入高浓度的脱水剂中，影响脱水效果。
3.2.4 透明
组织经过脱水之后，需要经过浸蜡的媒剂进行透明，主要的目的是使石蜡完全渗透到组织中，能够起到对包埋的支持作用。目前常用的脱水剂主要是酒精等，需要使用一种既可以和酒精又能和石蜡相混合的媒剂，在组织脱水之后，浸蜡之前将所研究的组织放置到该媒剂中。
3.2.5 浸蜡
组织经透明作用之后，被转移到熔化好的石蜡内浸渍，石蜡完全浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡 。根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要能够保持于 54－60℃温箱内进行。
3.2.6 包埋
将已经经过上述处理的组织块从蜡浴取出后置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
FFPE 块优先建议保存在 2-8℃环境下，保证保存环境干燥，且样本不可在阳光下暴晒。
4 Xenium 新鲜样本原位分析样本制备流程
新鲜组织 OCT 包埋干冰速冻和（左图）和新鲜组织 OCT 包埋异戊烷速冻（右图）
4.1 所需试剂和耗材
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名称 |
厂商 |
货号 |
备注 |
提供方 |
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OCT 组织包埋液 |
Sakura |
PN-4583 |
湿冰或4℃冰箱预冷≥30min |
客户自备 |
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异戊烷+液氮 |
Sigma（异戊烷） |
270342（异戊烷） |
异戊烷+液氮/干冰，选择一种方式 即可 |
客户自备 |
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干冰 |
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干冰用研钵和杵敲碎为干冰碎，以保证包埋过程中组织受冷均匀 |
客户自备 |
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组织包埋盒 |
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湿冰或4℃冰箱预冷≥30min |
客户自备 |
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医用手术刀 |
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湿冰或4℃冰箱预冷≥30min |
客户自备 |
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医用镊子 |
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湿冰或4℃冰箱预冷≥30min |
客户自备 |
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吸水纸 |
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客户自备 |
4.2 新鲜组织包埋操作具体步骤
4.2.1 样本标记
在包埋盒的四边用记号笔标记方向并写上样品名称（如图 1 和图2）。主要目的是后期包埋完成后，记录样本切面的方向，作为基础信息提供给切片选片环
节（组织放入包埋剂时建议目标切面朝上，方便后续切片时寻找目标切面）。请客户务必对包埋固定前的组织进行拍照，并提供于样本预约单中。
*该步骤缺失将导致无法确定组织目标截面及最大截面，增加选片环节组织暴露时间，或被迫多个方向变更进行切片选择，将导致过程中组织核酸降解，表达水平检出降低。
图 1：包埋方位标记（左图，正面与上下左右侧；右图，底部）
图 2 ：组织包埋时目标组织在包埋盒中的形态及切片方向示意
4.2.2 取样
建议新鲜的组织样本大小为长×宽不要过大，用实验专用吸水纸擦干表面（防止冰晶的形成）。
备注：建议多寄送一份备份样本。如样本较难获取，只寄送一份样本也可，此样本的高度达到 5mm 以上，以保证足够用于质检和正式实验。（默认单次切片厚度 10μm）
注意：新鲜取样后务必在 30min 内开始包埋。若无法立即包埋，须在包埋前将样本置于合适的组织保存液/培养基中并于湿冰上暂保存，请勿干燥暴露在空气中。
4.2.3 包埋
向预冷的包埋盒中加入少量的 OCT（铺满包埋盒底部 2-3 mm），不要引入气泡，再将上述修剪好的组织块找好角度放在组织包埋盒中。接着往包埋盒中加入 OCT 完全浸没组织块，如下图 3 。因为 OCT 比较黏，在整个加入过程中，务必不要引入气泡。
注意：包埋时组织的摆放角度十分重要，请将 6.5mm×6.5mm 的横切面平行于包埋盒底部进行包埋，建议切面朝上（图4），我司收到样品后将默认按照平行于包埋盒底部的角度进行切片。
图 3 ：OCT 包埋液中的组织
图 4 ：包埋时的组织界面图（以肾组织为例，建议将关注的切面朝上放置并可以提供类似照片以便选片）
4.2.4 速冻
将组织包埋盒放在干冰粉上速冻3-5min 直至包埋剂变硬变白（如图5） 或者将包埋盒置于预冷的异戊烷-液氮浴上（可以用镊子提托住包埋盒，避免包埋盒被异戊烷浸没），然后等待 OCT 凝固变白（如图 5）。
注意：在干冰盒中放入足够的干冰，建议使用碎干冰便于样本在冷冻过程中保持水平并均匀受冷；若只有块状干冰，可事先将干冰敲碎成干冰碎；
干冰速冻包埋/异戊烷速冻包埋任选一种方式即可。
图 5 ：干冰速冻包埋后的组织（左图）和异戊烷速冻包埋后的组织（右图）
4.2.5 寄送与保存
包埋后的组织固定到包埋盒中，对组织于包埋盒中的位置等信息进行标记，并拍照记录未冷冻时组织于包埋盒中的形貌以及分布（此处照片随《联川生物样本信息收集表》一同发给我司负责人（备注：根据自身实际情况进行调整））；
在包埋盒上标记好样品名称，转入 自封袋内标记好，装入充满足够干冰的泡沫盒中，随打印好的样品提交单一起寄出。如暂不送样，先保存在- 80℃冰箱中（一般可保存 3 个月左右）。
二、其他注意事项
1. 在确保实验准确性和可靠性的前提下，有可能出现样品不能成功完成全流程实验，其原因可能是①组织在长时间液体反应清洗过程中，发生组织脱落，或者组织移位，导致影响解码成像风险极高，不建议进行后续实验；②组织特性如石蜡组织面自身存在组织破损时，或者组织截面自身较为细碎时或者组织包埋质量原因将存在在长时间液体反应中更进一步破损扩大或者组织脱落移位的风险，严重时影响解码成像。
2. 组织特性或者组织包埋质量原因导致在 Xenium Analysis 内进行解码成像时，
由于反复的成像洗脱导致组织在 Xenium 芯片上大面积脱落，该阶段处于仪器运行中无法在过程中发现，实验无法终止，请甲方知悉。
3. Xenium 成本较高，试剂需要按需采购，订购周期预计在 35 个工作日左右乙方一旦采购下单，甲方均需要承担对应的费用；
4. 个性化探针定制费用，甲乙双方确认没有问题并下单，甲方均需要承担所对应的费用；
5. 如需甲方自己贴片，不论后期是否进行正式实验，Xenium 芯片的费用均需甲方承担，Xenium 芯片的费用 6000 元/芯片；
6. Xenium 运行需要 2 张芯片并行，如甲方是单张芯片，需要等待凑片时间；
7. 基因表达水平与样品自身特性有关，不同样品间存在一定差异是正常的。
三、风险样本及原因
原则上高脂肪、高钙化、高致密性、高结缔组织（皮肤/脂肪/硬骨/软骨/主动脉斑块/滑膜/韧带/肌腱/脐带等）以及本身细胞少，RNA 含量更少（血管组织、角膜组织、有研究本身样本中细胞类群很少的如卵母细胞等）的样本目前不建议做Xenium ，探针很难结合到转录本上且组织细胞含量较低，后续数据分析基本拿不到很多的数据，不建议做 Xenium原位分析；
四、运输说明
针对于新鲜组织包埋建议干冰运输，将样品从冻存环境中取出，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中，样品的上下和四周都用干冰填满，将泡沫盒子封好后邮寄。
24 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 5kg；48 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 10kg；72 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 15kg 。注意：运输过程中包埋样本切勿冻融！
针对于 FFPE 样本建议采用密封室温或者冰袋运输。