华大stereo-seq空间转录组样本准备及运输指南
1. 目前针对新鲜样本优先建议采用干冰进行 OCT 包埋的方式，建议新鲜取样后半小时内直接用OCT 进行包埋并用干冰速冻，干冰建议敲碎成为碎干冰后再进行包埋，这样可以最大程度地实现包埋过程中组织受冷均匀。
2. 对于特殊样本，建议尝试异戊烷冷浴的方式进行 OCT 包埋。
3. 禁止直接用液氮进行 OCT 冷冻包埋，液氮的沸点低，包埋盒直接放入液氮后会沸腾，在周围产生气穴，导致降温过程中不同区域降温不同，影响组织形态。
注意：两种方式选择任意一种方式进行包埋，联川提供相应操作视频。操作过程中均需要快速处理，避免组织长期置于常温下，同时避免反复冻融操作，目的是防止组织形态改变和 RNA 降解。此外，组织离体后一般会经过 PBS 或者生理盐水清洗表面血渍，在包埋前务必用滤纸等材料将组织表面水分吸干，以免在包埋中组织表面形成冰晶，后续切片容易断裂。
（Stereo-seq；适用于全物种新鲜冷冻样本）
1.新鲜组织包埋（干冰速冻）
可按照“ 1.1 新鲜组织包埋（干冰速冻）”的流程完成样本 OCT 包埋工作。
图 6 包埋简要流程示意图
1.1所需试剂和耗材
|
包埋试剂 |
品牌/规格/要求 |
包埋耗材 |
品牌/规格/要求 |
|
OCT 干冰 |
Sakura ，USA使用时需要打碎 |
包埋盒（塑料/金属均可） / 培养皿 无尘纸/无菌无纺布 不锈钢抹刀 自封袋 锡箔纸 记号笔（油性） |
7×7×7mm 或 15×15×7mm / / KIMBERLY-CLARK 可用直头无齿镊子替代 120×80mm / 不可选择水溶性 |
1.2 新鲜组织包埋操作具体步骤
（1）准备工作 1：需提前 30min 准备 1 个装有冰的冰盒，1 个装有碎干冰的干冰盒（或 1个控温良好的-80℃冰箱）；
（2）准备工作 2 ：塑料包埋盒的选择需考虑组织大小，以切面<1×1cm 的组织为例，建议选择 15×15×9mm 规格的包埋盒；
（3）准备工作 3：向包埋盒中倒入约 2/3 的 OCT ，并将包埋盒置于冰上预冷， 同时整管的OCT 插入冰中维持低温；
（4）去除组织表面液体：离体 30min 内，取尺寸合适的组织块，使用无菌无纺布/无尘纸靠近组织表面，吸干组织表面血液或组织液（严格执行），否则易在组织表面形成冰晶，破坏组织结构；
（5）OCT 包裹组织：对于实质紧实的组织，可将其放入盛有预冷 OCT 的平皿中，使用抹刀翻滚组织以使其与 OCT 充分接触；若组织质地松散，则需尽量减少移动操作；
（6）OCT 包埋：用抹刀将组织转移至冰上预冷的包埋盒中，并调整好位置及切面方向，通常包埋盒底面为切面；
（7）OCT 浸没组织：向包埋盒中填入预冷 OCT ，使组织完全被 OCT 覆盖，并使用注射器或其他工具排尽组织周围的气泡；如果是多空隙组织，如肺，组织放于包埋盒中，需冰上孵育 10min ，期间用抹刀轻触组织，帮助组织内部气泡排出。
（8）组织排布信息获取：对组织于包埋盒中的位置等信息进行标记，并拍照记录未冷冻时组织于包埋盒中的形貌以及分布（此处照片随《联川生物样本信息收集表》一同发给我司负责人（备注：根据自身实际情况进行调整））；
标记规则请参看下图 7 包埋样本的信息标记规则。
图 7 包埋样本标记示意图
1 OCT 组织包埋块需要标记组织方向，组织所在位置，样本名称等信息，如上图7 所示；
2 切面需标记“*”或“切面” ，在切片时实验员将从标记面开始切片；
3 在不做任何标记的情况下，默认背对包埋盒底部的一侧为切面（见图 7 右图“第一刀 ”位置）；
4 如果由于标记不清楚导致的切面错误损失样本，需要客户重新包埋送样。
（9）将锡纸包好的样本放于尺寸合适的塑封袋中封 口，存于-80℃冰箱，1 个月内寄送给我司进行实验（备注：具体多久提供请根据实际情况自行修改）。
2. 质检标准
1 组织切片形态完整，无断裂；
2 提取的 Total RNA RIN 值≥7；
表 1：时空组组织用量参考表
a. 本表用量评估的是 OCT 包埋样本的Z 轴距离，即组织厚度；
b. 同一样本进行多个实验（质检，透化，建库），每步重新封存后进行下次实验时总量会有大约 10 张切片的损耗；
c. 在样本制备及送样时，除考虑自身项目需求外，需要考虑寄送样本是否可满足消耗量需要。通常情况下，尺寸较大且无精细切面要求的组织，需额外准备至少 1 个备份样本。尺寸小或者全切样本，需额外准备至少2 个备份样本。
Tips：
(1) 新鲜组织请严格保证离体 30min 内进行直接 OCT 包埋，最大程度上避免组织内部 RNA 降解。
(2) 组织切面不大于芯片面积（标准芯片大小为 1×1cm 和 0.5×0.5cm ，其他尺寸芯片需要定制）。
其他注意事项
l 华大时空平台的空间转录组实验默认是通过 H&E 染色选片，选定区域后的临片进行实验，如需免疫荧光选片，需要提前和客户沟通好是什么荧光，目前我们的扫片仪器只有 DAPI（350/400/460）和 Orange（546/556/572）两种荧光选择模式。
风险样本及原因
l 原则上高脂肪、高钙化、高致密性、高结缔组织目前不建议做空转，组织透化荧光信号强度较低，继续实验后基因表达得到的基因信息较少（皮肤/脂肪/硬骨/软骨/主动脉斑块/滑膜/韧带/肌腱/脐带等）；
l 本身细胞少，RNA 含量更少的样本，组织透化的时候荧光信号极低，后续数据分析基本拿不到很多的数据，不建议做空间转录组测序（血管组织、角膜组织、有研究本身样本中细胞类群很少的如卵母细胞等）；
l 动物肺组织由于存在肺泡等空洞区域，如采用新鲜样本 OCT 包埋，后续切片会有断裂或者区域缺失的问题，建议在离体前进行灌注，灌注具体方法：用 50% OCT 和 50% PBS v/v（即 1:1 稀释的 OCT）灌流充盈肺泡。后续按照正常新鲜组织 OCT 包埋流程开展包埋实验，切片断裂缺失的情况会好一些。备注：OCT 粘度极高，灌注对操作要求过高。
运输说明
干冰运输：将样品从冻存环境中取出，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中，样品的上下和四周都用干冰填满，将泡沫盒子封好后邮寄。24 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 5kg；48 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 10kg；72 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 15kg 。注意：运输过程中包埋样本切勿冻融！针对于 FFPE 样本及其白片建议采用密封室温或者冰袋运输。