空间组学

1.空间代谢组项目样本准备

1.1 所需耗材及试剂

1)   包埋剂

购买链接：羧甲基纤维素钠（ CMC）; C299502 ; 粘度 ：50-200 mPa.s。

https://www.aladdin-e.com/zh_cn/c104984.html

包埋剂配制方法：如 2% CMC 配置方法为 ：2g CMC  粉末+98mL 超纯水。在 90℃（水浴或烘箱）累计加热共 36 h 左右至完全溶解（用密封容器装 ，以免加热过程中水蒸发 ，例如 50mL 离心管。可夜间停止加热 ，累计加热共 36 h 左右即可）。

注：适合空间代谢的包埋剂为 CMC、明胶等（OCT、石蜡包埋后的切片物质检出数量较低，不推荐）。明胶不利于贴片，所以更推荐用 CMC 进行包埋（配制包埋剂溶液，可选 2%-4%的羧甲基纤维素（ CMC）； 10%-25%的明胶）。使用不推荐的包埋剂需提前咨询。

包埋时需先将 CMC 配置好之后再取样 ，因包埋剂配置时间较长 ，样本裁剪后无法长时间放置。

常温状态下 CMC、OCT 呈浓稠的透明色流动状态 ，明胶呈微黄色果冻状固态 ，使用前需在热水中复温融化呈微黄色流动状态（明胶对温度比较敏感 ，常温低温容易变成果冻状）。

2)   包埋模具（根据样本大小及需求选择即可）。

3)   样本存放容器：根据样本大小选择合适的容器做为运输容器 ，如冻存盒。

4)  其他：无尘纸、培养皿、镊子、手术刀、干冰、泡沫箱、 ITO 玻片（客户自行切片时需求）等。

1.2  样本采集及总体要求

样本取材前 ，应先确认好最佳取材位置以及合理组织大小 ，剔除结缔组织、脂肪组织等非研究所需的组织类型，新鲜组织样本取下后迅速用干净的无尘纸吸干组织表面液体（此步骤一定要吸干水分，如有液体残留 ，包埋后 ，组织表面易形成冰晶 ，影响切片效果）。整个样本取样过程需要在冰上操作保持低温环境。

空间代谢组能接受的样本大小为：

以目标切片平面定义长宽组成的平面 ，送样到公司的样本最大尺寸：长（30mm）宽（15mm）高（即厚度 ，25mm） ，如过大 ，需新鲜样本时分割取关注区域 ，冷冻状态易碎裂。

以目标切片平面定义长宽组成的平面 ，送样到公司的样本最小尺寸：长（1.5mm）宽（1.5mm）高（即厚度 ，2mm） ，如过小 ，供切片使用的量太少 ，包埋很难平整。

过大或过小均会影响切片 ，若组织块大小超过最大值 ，请在新鲜样本时用刀片切除组织到规定大小以内 ，再进行下一步包埋或速冻 ，包埋或速冻后再对样本进行切割 ，切割时样本有不规则碎裂的风险。（如特殊情况大小无法符合要求 ，需单独进行售前评估或自行切片）

1.3  组织包埋寄送（首选）

1.3.1 样本包埋

1)   将包埋剂、包埋模具等放在冰上预冷 ，包埋模具四边用油性记号笔标记方向及样本名称（如图 1和图 2）。主要目的是后期包埋完成后 ，可以记录样本切面的方向 ，方便后期切片选片。

2)   在包埋模具中轻轻加入一层包埋剂 ，然后用预冷的镊子迅速将组织放入。添加包埋剂使其覆盖组织 ，并调整组织在包埋剂中的位置 ，保证目标平面与切面水平一致（包埋时组织的摆放角度十分重要 ，请将组织横切面平行于包埋盒底部进行包埋 ，建议切面朝上 ，如有特殊情况 ，请提前说明并在包埋盒上标注样本切面方向） ，保持样本在中部位置 ，并对包埋固定前的组织拍照记录。

注：在包埋过程中 ，不要引入气泡 ，气泡的产生会在包埋剂冷却后在组织周围形成空洞 ，影响切片效果（如有气泡产生 ，用针尖轻缓挑出或用空的移液枪头吸出）。

图 1 ：包埋方位标记（左图 ，正面与上下左右侧；右图 ，底部）

图 2 ：组织包埋时目标组织在包埋盒中的形态及切片方向示意

1.3.2 速冻

包埋好后 ，立即将其放在干冰上（或用镊子夹紧包埋盒放入装有液氮的容器中 ，使液氮没过其底部但不淹没整个包埋盒 ，不要使液氮浸入包埋盒内） ，当包埋剂由透明转变为完全不透明的白色结晶块状时 ，组织基本完全冻结 ，待包埋剂完全冻结 ，取出包埋盒 ，置于干冰或-80℃冰箱保存。

注：干冰建议敲碎成为碎干冰后再进行包埋，这样可以最大程度地实现包埋过程中组织受冷均匀。

图 3 ：包埋剂中的组织

图 4：包埋时的组织界面图（以肾组织为例，建议将关注的切面朝上放置并可以提供类似照片以便选片）

l 注意事项：

1)   样本从采集到包埋速冻，时间越短越好，尽量不要超过 10min，包埋好的样本立刻放入-80℃冰箱冻存。

2)   对于一般动物组织样本建议能包尽包 ，包埋可对样本起到固定、保护作用 ，尤其是含水量较高、体积较小、外形难保持、不规整的组织必须包埋固定。

3)   样本准备过程中未经过福尔马林浸泡、多聚甲醛固定、HE 染色、荧光标记等处理，建议使用 CMC包埋 ，不建议使用 OCT、石蜡包埋 ，非常影响代谢物检出。

4)   单个样本包埋 ，一个包埋块一个样本 ，不建议多个组织包在一起。

5)   包埋前要根据样本情况、关注的切面区域等因素 ，想好样本如何摆放？如何切片？包埋盒上要标记好样本名称、编号、样本放置方向、切片方向 ，在包埋过程中务必拍照记录 ，标记关注部位、病灶位置等信息 ，切片时需要提供。

6)   如暂不送样，则需要将包埋盒用锡箔纸包裹后，密封好（如用自封袋密封）放在-80℃冰箱中冻存。必须密封储存样本 ，否则可能会导致组织脱水和损伤。

7)   为保证实验的顺利 ，建议在取样同时做样本备份。

1.4  干冰/液氮速冻寄送（不建议）

建议对样本进行包埋后再进行样本寄送。但由于实验条件限制无法进行包埋步骤时 ，可以按以下步骤 ，对样本进行速冻后寄送。

样本采集步骤

1)   准备好用于包装样本的铝箔 ，并且用油性记号笔在铝箔外表多处写明样本编号。

2)   新鲜组织需要在冰冷的生理盐水中漂洗 3-5s，除去血液，滤纸拭干（尽可能保证组织无液体残留，防止冰晶的形成） ，将组织平放入锡箔纸做成的小盒子内（注意要切的平面朝向锡箔纸小船底部使之保存平放） ，并立即放入干冰中快速冷却 5-10min（样本与干冰间需用铝箔纸隔开） ，或置于液氮溶液上 15-30s（不要使液氮直接接触样本） ，待组织完全变白则表示组织已完全冻结。

3)   用适当大小的容器（容器不对样本进行挤压且方便取出样本 ，如冻存盒或冷冻保存管）装载锡箔纸包裹的组织 ，转入-80℃冰箱保存。

4)   使用加厚（2 cm）的泡沫箱，足量干冰寄送，保证样本全部埋在干冰当中，上下都有干冰覆盖（建议使用碎干冰便于样本在冷冻过程中保持水平并均匀受冷；若只有块状干冰 ，可事先将干冰敲碎成干冰碎）。

l 注意事项：

1)   冷冻过程需要迅速完成，尽量使样品保持原始完整形态，不要将样品塞进较小的保存管中再冻存，避免使用容易导致组织变形的材料包裹样本 ，以免组织变形。

2)   新鲜生物组织或冷冻组织样本准备过程中未经过福尔马林浸泡、多聚甲醛固定、HE 染色、荧光标记等处理。

3)   新鲜生物组织样本或冷冻生物组织样本准备过程中不可使用任何包埋剂如 OCT（ optimum cutting temperature compound）等 ，可能影响代谢物检出效果。

4)   禁止将样本不经锡箔纸包裹直接放入离心管中 ，这样容易使样本粘附在离心管壁上 ，不易取出，取出影响样本形态等后果。

5)   干冰寄送样品请在包裹外注明“冷冻”字样。

1.5  自行切片寄送（推荐 ，非必须 ，非常规样本建议寄送切片）

样本切片可由我司进行 ，也可客户自行切片 ，如果需要自己切片 ，需要提前准备 ITO 玻片。

切片流程如下（供参考）

1)   切片厚度一般在 8-50μm ，根据具体样本而定（人和动物样本一般为 12um） ，公司切片大小不超过 15*30mm ，最小不低于 1.5*1.5mm ，如客户自行切片 ，切片大小不超过 15mm*65mm。

2)   经-80°C 冰箱取出的组织放于-20°C 冰箱或切片机里-20°C 平衡 30 min。将样品固定到样品托头上 ，用移液器吸取 CMC 溶液于圆形样品托头上 ，并将组织放在 CMC 溶液上， 由于-20℃环境 ，待溶液结冰后组织即可固定。

注意事项：放组织时应尽可能将要切的平面保持向上并水平。

3)   把样品托头固定在切片机可定位样品头上 ，调整好样品的角度和方位。设置好切片厚度。然后调整好防卷板位置 ，转动手轮一圈 ，切出切片置于玻片上（若切片破裂 ，则样品头温度过低 ，应设置一个较高的温度。若切片软化 ，则样品头温度过高 ，应设置一个较低的温度）。

4)   将切好的切片用预冷的毛刷转移到预冷的 ITO 玻片上 ，将玻片背面贴紧手背 ，用手背的温度将组织切片融化至透明 ，透明后通过手指摩擦玻片背面 ，通过背面的温度将玻片正面组织上的水分蒸干 ，组织会由透明变白。在切不同组织样本之前应用纯乙醇擦拭平台和防卷板 ，以避免样品之间的交叉污染。

5)   切完后将含有组织的 ITO 玻片放入玻片盒中 ，玻片盒于-80°C  保存。需要运输时用干冰 ，将玻片盒放入干冰中寄送。

注：若客户自己切片时 ，需要切 3 份样本（1份正式样本 ，2 份备份样本 ，均为 ITO 玻片 ，建议用 A、B、C 做好标记用于区分）寄送到公司进行空间代谢检测。若玻片在检测过程中仪器故障，会用备用进行检测 ，如需进行 HE 染色等其他实验 ，请自行保留普通玻片贴片的样本。

l 注意事项：

1)   贴 ITO 玻片时 ，务必将样本切片贴在玻片正面（带氧化铟锡涂覆层的一面）。当 ITO 玻片水平放置在桌面上 ，标记点在右上角时 ，朝上的那面即为正面。

2)   整个玻片大小为 75mm*25mm ，组织切片的摆放位置尽可能放置在绿色区域内（约 8cm²)   ,  红色区域为预留的空间 ，用做靶板的空间位置校正 ，需要留出。样品占太满、交叠 ，或者太靠近边缘 ，均会影响质谱成像的数据质量。

3)   同一张 ITO 玻片上可放置多个样本 ，相互比较的样本建议放置于同一张玻片上 ，样本数量随检测分辨率和单个样本切片的面积大小而定 ，切片间排放间隙 ：5mm。

4)   样本名称标记在边缘位置 ，请勿标记在样本周围影响检测。

1.6  特殊样本准备（植物叶片、花瓣类）

1.6.1 样本采集步骤

选择样本前 ，应先确认好最佳取材位置以及合理组织大小（要求大小不超过约 19*60 mm） ，若组织块较大 ，请用刀片切除非必要部位。使用卷起来的实验室擦拭布从组织表面吸收多余的汁液或水分 ，以避免冰晶的形成。

对于植物叶片类组织（如叶、花瓣） ，叶片组织一共可以分为两个面：

1）可切片的叶片截面（即切出来为细长条的截面），若成像区域为叶片截面，则要求截面厚度需要大于 1.5mm。平面的大小需要小于 30mm X 15mm，按常规样本要求用 CMC 包埋后进行送样（参考 1.2 组织包埋寄送步骤），进行操作。若叶片大于这个面积或厚度小于等于 1.5mm，需自行切片（或剪裁至要求面积）。

2）中间为主叶脉左右对称的叶片平面（不可切片，需要压印，暂不接收此类样本，特殊情况请提前沟通咨询）（通常要求样本厚度≤300 μm 的植物新鲜叶片，蜡质层较厚的叶片，蜡质面检出效果不好）。

注：每个样本建议送 3 份（1份正式样本，2 份备份样本，建议做好标记用于区分）。若在压片或检测过程中仪器故障时，会用备用样本进行检测 ，植物样本默认不进行 HE 染色。

1.6.2 叶片、花瓣样本运输

1)   包装

方式 1：将铺平的叶片或花瓣置于标记好编号的硬质塑料板上 ，并用保鲜膜包裹住塑料板及叶片，以防止叶片在运输途中移动导致破碎 ，然后再覆盖一层锡箔纸 ，盒中上下铺置棉花进行缓冲。样本较多一块板放不下时 ，建议将同组样本放在一起块硬质塑料板上 ，不同组样本放在不同硬质塑料板上。

方式 2：当无实验条件时，也可选择方式 2。将叶片或花瓣置于标记好编号的锡箔纸中，将包有样本的锡箔纸置于较大的容器内（例如冻存盒） ，且盒中上下铺置棉花 ，将包有样本的锡箔纸存放于棉花中间 ，防止邮寄过程中叶片碰撞碎裂。

2)   寄送

冷冻盒于-80°C 冰箱保存，运输时干冰寄送。干冰寄送时，将容器（例如冻存盒）埋没于干冰中，保证上下都有干冰覆盖 ，干冰的量根据每天 4 公斤来计算 ，使用厚实的泡沫箱寄送。

2.空间代谢组-空间转录组联合项目样本准备（只接受医学类样本）

2.1 所需耗材及试剂

1)   包埋剂：徕卡 Cryo-Gel 包埋剂（Leica Cryo-Gel Embedding Medium ，Item No. 14020108926）或 FSC22 蓝色包埋剂（ Leica FSC22， Item No. 3801481）（公司提供或客户自备）

注：空间代谢空间转录组联合必需使用徕卡 Cryo-Gel 或 FSC22 包埋剂。此包埋剂为配置好的溶液 ，可直接使用。储存条件： 15 ℃ ~ 30 ℃。每个样本需要用 7 mL 包埋剂和 1 个包埋盒。

2)   包埋盒

3)   样本存放容器：根据样本大小选取合适容器运输 ，较大组织可使用冻存盒 ，切勿容器过小挤压组织。

4)   其他：吸水纸、培养皿、镊子、手术刀、液氮、异戊烷（推荐购买 Sigma 厂商的货号 270342）、 ITO 玻片、世泰防脱玻片（货号： 188105）。

2.2 新鲜组织包埋寄送准备流程

2.2.1 包埋准备

在包埋盒的四边用油性记号笔标记方向并写上样品名称（如图1 和图 2）。主要目的是后期包埋完成后 ，可以记录样本切面的方向 ，方便后期切片选片（组织放入包埋剂时建议目标切面朝上 ，方便后续切片时寻找目标切面）。请务必对包埋固定前的组织进行拍照 ，并提供于样本预约单中。

*该步骤缺失将导致无法确定组织目标截面及最大截面，增加选片环节组织暴露时间，或被迫多个方向变更进行切片选择，将导致过程中组织核酸降解 ，表达水平检出降低。

将镊子、手术刀、包埋盒、包埋剂等放置在冰上（或置于 4℃冰箱）预冷 30 min。

注意：请勿用水性笔做标记 ，遇水容易脱离。

图 1 ：包埋方位标记（左图 ，正面与上下左右侧；右图 ，底部）

图 2 ：组织包埋时目标组织在包埋盒中的形态及切片方向示意

2.2.2 取样及样本要求

取新鲜组织样本 ，需先确认好最佳取材位置 ，尽量保证目标组织完整性 ，并将组织修剪至合适大小。因空转芯片的面积为 6.5mm×6.5mm，建议新鲜的组织样本大小为长×宽不超过 6.5mm×6.5mm，不小于 1.5mm×1.5mm ，高度≥5mm 的组织块 ，取样后迅速用实验专用吸水纸吸干表面液体 ，如血液等（尽可能保证组织无液体残留 ，防止冰晶的形成）。

注意：取样过程中需要再冰上操作保持低温环境。新鲜取样后务必在 30min 内开始包埋。若无法立即包埋 ，须在包埋前将样本置于干净的离心管或密封袋中 ，埋入湿冰中短暂保存（小于 30min）。

2.2.3 包埋

向预冷的包埋盒中加入少量的包埋剂（铺满包埋盒底部2-3 mm） ，注意不要引入气泡 ，再将上述修剪好的组织块找好角度 ，用预冷的镊子迅速放在组织包埋盒中 ，调整组织位置（组织切面平行于包埋盒底部进行包埋 ，建议切面朝上） ，接着往包埋盒中加入包埋剂（建议从中心区域开始） ，使之完全浸没组织块 ，如下图 3。

注意：

1）在整个包埋过程中，不要引入气泡，气泡的产生会在包埋剂冷却后在组织周围形成空洞，影响切片效果（如有气泡产生 ，用针尖轻缓挑出或用空的移液枪头吸出）。

2）包埋时组织的摆放角度十分重要，请将 6.5mm×6.5mm 的横切面平行于包埋盒底部进行包埋，建议切面朝上（图 4） ，我司收到样品后将默认按照平行于包埋盒底部的角度进行切片。如有特殊情况 ，请提前说明并在包埋盒上标注样本切面方向。

3）使用倒置的方式保存和放置包埋剂，可减少气泡产生，包埋剂瓶口稍剪大一些，先将包埋剂向纸巾挤出一些 ，确保瓶口空气全部排出后 ，再向模具中添加包埋剂。

图 3 ：包埋剂中的组织

图 4：包埋时的组织界面图（以肾组织为例，建议将关注的切面朝上放置并可以提供类似照片以便选片）

2.2.4 异戊烷/干冰速冻

将组织包埋盒放在干冰上速冻 3-5min 直至包埋剂变硬变白（如图5） 或者将包埋盒置于预冷的异戊烷-液氮浴上（可以用镊子提托住包埋盒，使异戊烷没过其底部但不淹没整个包埋盒，务必避免包埋盒被异戊烷浸没 ，以防止异戊烷与包埋剂混合） ，然后等待包埋剂有透明凝固变白 ，此时组织基本完全冻结（如图 4）。

注意：

1）干冰速冻时：在干冰盒中放入足够的干冰，建议使用碎干冰便于样本在冷冻过程中保持水平并均匀受冷；若只有块状干冰 ，可事先将干冰敲碎成干冰碎；

2）异戊烷-液氮浴速冻时：在金属容器中倒入 2/3 异戊烷 ，再将金属容易放在液氮中 ，异戊烷在液氮中预冷 10-15 min。装置中 ，液氮和异戊烷需要处于同一水平线。异戊烷预冷时间长会出现结冰情况，如未满 15min 就出现结冰现象，则可以缩短预冷时间 ，当异戊烷结冰时，可将异戊烷从液氮中取出室温放置一小段时间。

3）干冰速冻包埋/异戊烷速冻包埋任选一种方式即可。

图 5 ：干冰速冻包埋后的组织（左图）和异戊烷速冻包埋后的组织（右图）

2.2.5 样本运输及保存

包埋后的组织固定到包埋盒中 ，用油性记号笔在包埋盒上标记好样品名称 ，将包埋盒用锡箔纸包裹并做好样本信息标记 ，将包埋盒放入密封容器中（如冻存盒中） ，以避免组织脱水和损伤或被干冰挤压导致样本破碎 ，装入充满足够干冰的泡沫盒中 ，将样本没于干冰中 ，随打印好的样品提交单一起寄出（电子版提交单可联系销售经理提供）。

如暂不送样 ，将包埋盒密封好后先保存在- 80℃冰箱中冻存（一般可保存 3 个月左右）。

2.3 自行切片寄送

样本切片可由我司进行，也可客户自行切片，如果需要自己切片，需要提前准备世泰玻片（空转）及 ITO 玻片（空代）。

2.3.1 切片流程如下（供参考）

1)   切片厚度一般在 8-50μm ，根据具体样本而定（人和动物样本一般为 10um） ，切片最大不超过15*30mm，最小不低于 1.5*1.5mm，空转芯片大小为 6.5mmX6.5mm ，目标区域大小需要和芯片配对 ，需要圈出待检测区域 6.5mmX6.5mm 范围内样本。

2)   经-80°C 冰箱取出的组织放于-20°C 冰箱或切片机里-20°C 平衡 30 min。将样品固定到样品托头上 ，用移液器吸取 Cryo-Gel 或者 FSC22 蓝色包埋剂溶液于圆形样品托头上 ，并将组织放在Cryo-Gel 或者 FSC22 蓝色包埋剂溶液上在-20℃环境待溶液结冰后组织就固定了。

注意事项：放组织时应尽可能将要切的平面保持向上并水平。

3)   然后把样品托头固定在切片机可定位样品头上 ，调整好样品的角度和方位。设置好切片厚度。然后调整好防卷板位置 ，转动手轮一圈 ，切出切片置于玻片上（若切片破裂 ，则样品头温度过低 ，应设置一个较高的温度。若切片软化 ，则样品头温度过高，应设置一个较低的温度）。

4)   将切好的切片用预冷的毛刷转移到预冷的世泰/ITO 玻片上，将玻片背面贴紧手背 ，用手背的温度将组织切片融化至透明 ，透明后通过手指摩擦玻片背面 ，通过背面的温度将玻片正面组织上的水

分蒸干 ，组织会由透明变白。在切不同组织样本之间应用纯乙醇擦拭平台和防卷板 ，以避免样品之间的交叉污染。

5)   切完后将含有组织的世泰/ITO 玻片放入玻片盒中 ，玻片盒于-80°C 保存。需要运输时用干冰 ，将玻片盒放入干冰中进行运输寄送。

2.3.2 贴片区域要求

空间代谢组 ITO 玻片贴片区域（参考 1.4）

图 5： ITO 玻片实际的贴片范围（绿色框出来的区域）

空间转录组世泰玻片贴片区域

图 6： 10x Genomics 官方推荐玻片有效区域

图 7 ：组织尽量贴在玻片正中位置

5. 本身细胞少，RNA 含量更少的样本，组织透化的时候荧光信号极低，后续数据分析基本拿不到很多的数据 ，不建议做空间转录组测序（血管组织、角膜组织、有研究本身样本中细胞类群很少的如卵母细胞等）。

6. 动物肺组织由于存在肺泡等空洞区域 ，空转需要灌注，不建议进行空转空代联合项目。

3.组织质检要求

1)   空间代谢组：组织切片形态完整 ，厚薄平均， 目标捕获区域无断裂 ，无气泡 ，无褶皱、折叠、无污染物（血液残留等）。

2)   空间转录组：组织切片形态完整 ，厚薄平均， 目标捕获区域无断裂 ，无气泡 ，无褶皱、折叠、无污染物（血液残留等） ，细胞核与细胞质染色清晰明显 ，切片无松散 ，表达区域满足客户需要。

10x Visi um CytAssist 平台： RIN≥4；

10x Visi um 平台： RIN≥7；

4.样本信息单填写

样本信息单用于描述并记录每次运送检测样本类型、数量、状态及检测要求。寄送样本前请填好此表格（电子版送样单请联系销售经理提供） ，电子版填好后发送至项目联络人或销售经理 ，打印一份纸质原件装入密封袋中 ，随样本一同寄送。关于信息单如何填写 ，可参考《信息单填写说明》 ，不清楚的地方可咨询销售经理。空转和空代同时做需要分别填写。

5.干冰运输说明

干冰运输：将样品从冻存环境中取出 ，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中 ，样品的上下和四周都用干冰填满，样本没于干冰中，将泡沫盒子封好后邮寄。24 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 5kg；

48 小时内能够到达的 ，干冰重量不得低于 10kg；72 小时内能够到达的 ，干冰重量不得低于 15kg。

注意：运输过程中包埋样本切勿冻融！如暂不送样 ，则需要将包埋盒密封（如用自封袋密封）好后放在-80℃冰箱中冻存。必须密封储存样本 ，否则可能会导致组织脱水和损伤。

 6.收样地址

植物样本：客户需将所关注部位修剪好大小进行液氮速冻后 ，用铝箔纸包裹装入离心管或冻存盒中 ，我司会对客户所寄送的鲜样在切片之前进行包埋处理（否则无法切片） ，实验结果显示包埋后的样本 ，切片边缘形态较为完整 ，鲜样切片边缘会有部分损伤。

3)   Q：只做空间代谢检测 ，样本寄送前完整流程如何？

A：情况  1：鲜样处理 ，裁剪至合适大小→鲜样包埋→样本包装→填写提交单→干冰寄送

情况 2（没实验条件进行包埋）：鲜样处理，裁剪至合适大小→样本速冻→样本包装→填写提交单→干冰寄送→切片前包埋

情况 1 和情况 2，即所有样本默认需要客户使用 CMC 包埋，客户邮寄到公司的样本未包埋的，常规流程在切片过程中也会进行包埋。

客户包埋时需先将 CMC 配置好之后再取样， 因包埋剂配置时间较长 ，样本裁剪后无法长时间放置。

4)   Q：空间代谢组-空间转录组联合 ，样本寄送前完整流程及切片流程？

A ：鲜样处理 ，裁剪至合适大小→ 鲜样包埋→样本包装→干冰寄送 。所有样本默认需要客户使用Cryo-Gel 或者 FSC22 蓝色包埋剂包埋 ，客户如果无法购买到包埋剂 ，可联系销售寄送 ，我司会根据样本数量寄送对应重量包埋剂。

切片选片时，会提前跟客户预约时间，选片过程中需客户实时回复，大致流程为：空间转录组 RNA质检→ HE 染色选片→贴片。

通常贴片默认贴 1 张空转片（世泰玻片），3 张空代片（其中 2 张为空代备份片，均为 ITO 玻片），如有其他需求 ，请提前告知实验人员。

5)   Q：只做空间代谢检测 ，样本较大没有合适尺寸的包埋盒如何处理？

A：最大包埋盒为 30X20X12mm, 样本最大尺寸不超过长（30mm）宽（15mm）高（即厚度，25mm）如果所关注区域的尺寸大于包埋盒的尺寸 ，需要在包埋前对样本进行剪裁。

6)   Q：只做空间代谢检测 ，能否将样本整体寄送过来 ，由公司进行处理？

A：不建议如此做 ，因切片人员无法了解所有样本的结构 ，加之样本送来之后是已冷冻的状态 ，操作时需要将其冻融再凝固 ，形态结构会改变 ，无法保证后续实验结果。

7)   Q：样本包埋时有气泡如何解决？

A：可使用空的移液枪吸头将气泡吸出 ，或使用针尖将气泡挑出。

8)   Q：只做空间代谢检测 ，切片碎裂是什么原因造成的 ，为什么切片结果与书上的图片相差较大？

A：切片碎裂常见于植物样本 ，因其细胞内含有大液泡 ，冷冻状态下为凝固状态 ，在刀片压力的作

用下会碎裂 ，原理类似于刀切冰块 ，书上所提供的图片一般为石蜡切片 ，其经过固定脱水的前处理 ，故形态结构保持相对完整 ，且冰冻切片无法达到石蜡切片的效果 ，我司会将样本切片的碎裂程度尽可能降低。

9)   Q：只做空间代谢检测 ，切片碎裂是否影响检测？

A：在样本完整的前提下不影响检测 ，碎裂只是把一片样本分为多片小样本 ，不会对检测造成影响。

10) Q：只做空间代谢检测 ，切片反馈单给的 3 份切片如何选择？

A：若为一张 ，以整张玻片为单位依次选出最优、次优、较好等 ，将其依次排序 ，例如 A>B>C

若为两张及以上 ，以一张玻片为单位 ABC 组别可任意组合 ，例如 A2、 B3 >A3、 B2 ，尽量保证有多余切片。

11) Q：切片厚度为多少？

A：我司默认切片厚度为 8-50μm，会在保证样本完整的前提下选择较薄的厚度，只做空间代谢组，常规为 12μm ，空间代谢组-空间转录组联合 ，常规为 10μm。每份样本切 3 组 ，以 ABC 分类 ，客户根据扫描图选择完玻片的优先级后进行空间代谢组上机检测。

12) Q：切片不完整 ，或者有冰晶可以如何解决？

A：冰晶形成的原因是组织冷冻速度太慢。冰冻开始时 ，冰晶成核率较慢 ，以后逐渐增加 ，其临界

温度为-3.3℃ ,  从-3℃降至-4.3℃之间 ，成核率急剧增加，然后再减慢。冰晶的大小与其生长速率成正比 ，而与成核率（形成速率）成反比 ，即冰晶形成的数量愈多则愈小 ，对组织结构影响愈严重。可采取速冻措施减少冰晶的形成， 目前已知的方法有：第一，标本要尽量不含水，特别是一些含有黏液、体液这些东西 ，还有像含水丰富的组织如脑组织、乳腺等 ，我们可以用吸水纸将表面的水吸干一些 ，这样可以很大范围地减少冰晶。第二使用液氮 ，可快速冷冻组织 ，有效减少冰晶形成。第三 ，取样时将样本中的水分用蔗糖梯度替换。