简介
三代全长转录组测序技术是基于单分子实时测序（如 PacBio SMRT 或 Oxford Nanopore 技术）的新型转录组分析方法，其核心优势在于无需 PCR 扩增即可直接读取完整的 mRNA 序列（读长可达 10-20 kb），突破了传统二代测序的短读长限制。该技术通过超长读长精准解析转录本的 5’和 3’端边界、可变剪接（AS）、融合基因、转录起始位点（TSS）及多聚腺苷酸化（APA）等复杂结构，尤其适用于低表达丰度的全长异构体鉴定。技术原理上，PacBio SMRT 利用零模波导孔（ZMW）观察 DNA 聚合酶实时合成 cDNA 的过程，通过环形一致性测序（CCS）模式实现单碱基纠错，而 Oxford Nanopore 则基于纳米孔电流信号直接读取 RNA 分子，支持链特异性分析。其应用领域包括：肿瘤融合基因检测、单细胞全长转录本解析、长链非编码 RNA（lncRNA）功能研究及病原体全基因组转录本注释等，为揭示转录组复杂性提供了革命性工具。
应用场景与案例
应用场景1：全长转录本异构体发现与功能解析
适用范围：癌症研究、发育生物学、神经科学等复杂疾病机制研究。
技术价值：通过单分子测序直接获取完整 mRNA 序列，精准识别同一基因的不同剪接异构体（如癌症中的异常融合转录本），结合基因结构注释揭示新功能亚型。验证方法包括 RT-PCR 克隆测序、CRISPR-Cas9 敲除特定异构体后观察表型变化。
应用场景2：可变剪接（AS）全景图谱构建
适用范围：神经退行性疾病、免疫应答机制、植物抗逆研究。
技术价值：突破短读长限制，准确捕获跨外显子剪接事件（如 exon skipping、intron retention），结合样本间 AS 事件差异分析，揭示疾病相关剪接调控网络。验证手段包括 RNA 原位杂交（RNA-FISH）定位剪接异构体表达模式。
应用场景3：肿瘤融合基因精准检测
适用范围：肿瘤分子诊断、靶向治疗方案制定。
技术价值：无需依赖已知融合位点，通过超长读长直接识别跨染色体的嵌合转录本（如 BCR-ABL1 融合），结合链特异性分析区分正义 / 反义融合方向，检测灵敏度可达 0.1% 肿瘤细胞。验证方法为荧光原位杂交（FISH）或数字 PCR 绝对定量。
应用场景4：长链非编码 RNA（lncRNA）功能挖掘
适用范围：表观遗传调控、疾病标志物筛选。
技术价值：直接获取 lncRNA 完整序列，鉴定其启动子、polyA 位点及与 mRNA 的互作模式（如 ceRNA 机制），结合表观修饰数据（如 ChIP-seq）解析其调控网络。验证手段包括 RNA pull-down 联合质谱鉴定互作蛋白。
项目流程图
联川生物三代全长有参转录组测序可以为研究人员提供从样本提取、建库测序、数据分析等一系列完整的服务流程，提供高质量的数据结果，并为后续研究提供强有力的参考依据。
样本起始量与送样建议
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样本类型 |
起始量 |
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动物及临床脏器组织/脑组织等 |
>20mg |
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动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等 |
>100mg |
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原代细胞/细胞系 |
>1×10^7个 |
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中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞 |
>5×10^7个 |
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总RNA |
>10μg且RIN>7.0 |
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注意事项： ① 组织样本建议保存在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织保存液中，然后-80℃保存或干冰寄送； ② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，-80℃保存或干冰寄送 ③ 更加详细的样本准备指南，请发送邮件至 market@lc-bio.com 索要或联系驻地销售 |
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生物信息学分析流程与分析内容
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Smart-seq2 |
分析内容 |
备注 |
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测序数据及其质量控制 |
根据测序数据质量值（阈值默认为7），大于等于阈值的为pass，小于阈值的为fail |
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测序数据量统计 |
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全长序列鉴定 |
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比对参考基因组 |
参考基因组比对 |
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一致性转录本 |
一致性转录本序列统计 |
一致性转录本序列统计， 转录本去冗余 |
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转录本去冗余 |
染色体上比对序列分布统计 |
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新基因和新转录本分析 |
新转录本编码区序列预测 |
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新转录本数据库注释 |
Gene Ontology分类 KEGG Pathway分类 KOG 分类 Nr注释结果统计 |
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转录本及基因信息统计 |
转录本和基因数量 |
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转录本密度 |
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结构分析 |
可变剪切分析 |
所有样本可变剪切统计 差异可变剪切分析 |
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融合转录本分析 |
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SSR 分析及引物设计 |
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LncRNA预测 |
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poly(A) 分析 |
poly(A)位点分析 |
poly(A)位点的鉴定与分布 可变多聚腺苷酸化 可变 3’UTR |
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转录本分析 |
转录本表达定量 |
转录本表达的密度分布图、箱线图、样本相关性分析、主成分分析 |
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差异表达转录本分析 |
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基因分析 |
基因表达定量 |
基因表达的密度分布图、箱线图、样本相关性分析、主成分分析 |
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差异表达基因分析 |
包含GO富集柱状图、散点图、雷达图等 |
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所有转录本表达差异与Reference转录本表达差异的结果对比 |
表达量差异对比 |
基因水平无差异，转录本水平有差异的基因及转录本信息统计 |