FFPE单细胞转录组测序样本指南

1.适用样本类型

10x Flex适用石蜡包埋组织、固定的新鲜组织、固定的细胞/细胞核。对于穿刺样本或其他特殊样本需另行沟通评估。

2. 石蜡样本采集

2.1 石蜡包埋块

2.1.1 样本制备与保存

石蜡样本制备流程包括：取样-固定-脱水-透明-浸蜡，其中的环节注意事项：

1）取样到固定不超过30min，若30min内无法处理，于细胞保存液内4℃保存不超过48hr；

2）固定时间一般24hr，不超过72hr；

3）脱水时间根据具体组织而定，不过度脱水；

4）低熔点软蜡包埋；

5）蜡块切片后对石蜡块重新进行石蜡封片；

6）蜡块干燥、阴凉、通风、避光保存，建议密封后4℃冰箱保存。

2.1.2  组织量要求

1）蜡块组织面积≥1cm*1cm，厚度≥150μm（这是最小量要求，建议大于该厚度）；

2）蜡块组织面积＜1cm*1cm，厚度≥200μm（这是最小量要求，建议大于该厚度）。

2.1.3  运输

夏季密封后冰袋运输（4-8℃环境）；其余季节密封后常温运输。

 

2.2石蜡卷片

2.2.1 样本制备与保存

石蜡包埋组织块制备参考5.2.1.1 样本制备与保存。

2.2.2 切片制备

1） 质检切片数量要求

l 质检采用Qiagen提取试剂盒进行核酸提取评估完整性。

l 石蜡切片以厚度5μm制备2-4张白片；其中，组织面积≥1cm*1cm，准备5μm 2片；组织面积＜1cm*1cm，准备5μm 4片。

2）待解离组织卷片数量要求

l 人：组织面积≥1cm*1cm，厚度≥25μm/片，3片；组织面积＜1cm*1cm，厚度≥25μm/片，4-6片。

l 鼠：组织面积≥1cm*1cm，厚度≥50μm/片，3片；组织面积＜1cm*1cm，厚度≥50μm/片，4-6片。

卷片形态应完整如下图（左图所示）

 

图.11 石蜡卷片，图左：形态完整；图右：形态破碎

2.2.3  保存与运输

l 所有石蜡切片（卷片）即时制备，现切现寄送。

l 白片于玻片盒保存，卷片1.5mL离心管保存，塑料袋密封后夏季冰袋运输，其他季节常温运输。

备注：石蜡样本寄送请填写附件5：单细胞样本信息提交单（FFPE样本信息），打印随样本一并寄送。

 

3. 固定的新鲜组织

3.1 组织预处理和固定（客户现场自行操作）

固定过程中使用的专用试剂客户需自行采购：

表.4 固定试剂列表

 

1）取材后30min内完成处理，若30min内无法处理，单细胞保存液内4℃保存不超过48hr；

2）Fixation buffer配制方法如下：

 

3）擦去表面液体杂质后组织称重，按组织重量准备Fixation buffer（如下表所示）：

 

4）组织剪切

冰上预冷平皿上，用刀片或剪刀剪切成能过1mL移液器枪头尖的组织颗粒；

5）组织固定

l 按照组织重量加入相应体积的Fixation buffer，转入离心管，吹打混匀，4℃孵育16-24hr；

l 850 rcf室温离心5min，去上清，加入2mL 1xPBS重悬组织；

l 850 rcf室温离心5min，去上清，加入1mL冰上预冷的Quenching Buffer重悬组织，暂时冰上保存。

 

6）提前65℃孵育Enhancer 10min，涡旋混匀短暂离心后42℃保存；

7）组织悬液中加入0.1体积的Enhancer（eg.1000μL悬液中加入100μL增强剂），混匀，加入甘油至最终浓度为10%（例如:275μL 50%的甘油到1100μL已加增强剂的固定组织/细胞悬液中），混匀，-80℃保存6个月。

 

图.12 组织固定流程

 

3.2 送样量要求

组织重量不低于50mg。

3.3 运输

密封后干冰运输。

 

4. 固定的细胞/细胞核

4.1 样本预处理和固定（客户现场自行操作）

此处需提前制备单细胞/细胞核悬液，固定过程中使用的专用试剂客户需自行采购：

表.5 固定试剂列表

1）单细胞/细胞核悬液制备

按照不同组织选择合适的解离或抽核方法获得高质量细胞/细胞核，细胞/细胞核质量要求：

l 单细胞活率≥80%，结团率≤30%，有核率≥65%，细胞总量＞50w（50w-1000w）；

l 细胞核形态好，结团率≤25%，有核率≥70%，细胞核总量＞100w（100w-1000w）。

2）吸取足量的细胞/细胞核4℃ 300-400rcf离心min，去上清至残留约30μL液体，用枪头吹匀沉淀；

3）固定：如下表所示配制Fixation buffer

 

4）加入1mL Fixation buffer，枪头吹打混匀5次至充分混匀，4℃固定16-25hr；

5）850rcf室温离心5min，去上清，注意勿触碰沉淀；加入1mL冰上预冷的Quenching Buffer，枪头充分混匀沉淀，冰上放置；

 

6）提前65℃孵育Enhancer 10min，涡旋混匀短暂离心后42℃保存；

7）细胞悬液中加入0.1体积的Enhancer（eg.1000μL悬液中加入100μL增强剂），混匀，加入甘油至最终浓度为10%（例如:275μL 50%的甘油到1100μL已加增强剂的固定组织/细胞悬液中），混匀，-80℃保存6个月。

 

图.13 细胞/细胞核固定流程

 

4.2 送样量要求

细胞数量50w-1000w；细胞核数量100w-1000w。

4.3 运输

密封后干冰运输